吳慧，趙宇龍，王艷紅，房興堂，陳宏，張春雷

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實(shí)驗(yàn)研究

大鼠miR-142-3p、miR-145-3p表達(dá)模式分析

吳慧，趙宇龍，王艷紅，房興堂，陳宏，張春雷

摘要：目的篩選并鑒定對(duì)大鼠乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)控起關(guān)鍵作用的微RNAs（miRNAs）。方法以U6為內(nèi)參基因，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，比較miR-142-3p、miR-145-3p在泌乳21 d大鼠乳腺、肝、心、脾、肺、腎、卵巢、子宮各器官的組織樣品表達(dá)量的差異及不同泌乳階段（1、7、21 d）乳腺組織miR-142-3p、miR-145-3p的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果miR-142-3p在泌乳21 d各組織的表達(dá)存在差異，乳腺中的表達(dá)量顯著高于心、脾、肺、腎、卵巢和子宮，僅次于肝中的表達(dá)量（P＜0.05）。miR-145-3p在乳腺中的表達(dá)量顯著高于肝、脾和腎，而在心、肺、卵巢和子宮中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。乳腺組織在泌乳1、7、21 d比較，miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，而miR-145-3p的相對(duì)表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)。結(jié)論miR-142-3p和miR-145-3p在大鼠各組織及不同生理時(shí)期存在表達(dá)差異；miR-142-3p可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因催乳素受體（Prlr）來(lái)調(diào)控乳腺的發(fā)育和泌乳的形成，miR-145-3p可能具有與miR-145、miR-145-5p相似的功能。

關(guān)鍵詞：乳腺，動(dòng)物；微RNAs；肝；心臟；脾；肺；腎；卵巢；子宮；大鼠，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

母乳喂養(yǎng)是指用母親的乳汁來(lái)哺養(yǎng)嬰兒。母乳喂養(yǎng)有益于嬰兒和母親［1］。乳汁中的營(yíng)養(yǎng)成分能促進(jìn)嬰兒的健康成長(zhǎng)，其抗體可以提高嬰兒免疫力［2］。此外，母乳喂養(yǎng)也利于母親的產(chǎn)后康復(fù)。然而很多產(chǎn)婦患有生理性泌乳困難，對(duì)于這一問(wèn)題的解決還存在空白。因此，對(duì)泌乳機(jī)制的深入研究勢(shì)在必行。

微RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA。研究表明，miRNA在細(xì)胞增殖與分化、發(fā)育和凋亡、激素分泌、疾病發(fā)生等方面起著重要的調(diào)控作用［3］。目前，miRNAs多集中于乳腺疾病方面的研究［4］，其調(diào)控乳腺生長(zhǎng)發(fā)育和泌乳的報(bào)道很少［5］。已有研究證實(shí)miR-142-3p可以調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的增殖和乳汁的合成［6］；而miR-145-3p通過(guò)靶向胰島素受體激酶底物 1 （IRS1）來(lái)調(diào)控脂肪的合成［7］。本實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)乳腺組織miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出27個(gè)在乳腺中差異表達(dá)的miRNAs［8］。本研究以大鼠為模式動(dòng)物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)差異表達(dá)的miR-142-3p和miR-145-3p作進(jìn)一步驗(yàn)證并分析泌乳期不同階段miRNA的表達(dá)規(guī)律。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣品實(shí)驗(yàn)所用Sprague Dawley大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，相同條件下喂養(yǎng)，快速取泌乳1、7 d活體（各5個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的乳腺組織及21 d活體（3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）的乳腺、肝、心、脾、肺、腎、卵巢、子宮組織，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與儀器總RNA抽提試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒［PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）］、熒光定量PCR試劑盒［SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）］均購(gòu)于寶生物工程有限公司。臺(tái)式超低溫冰箱（德國(guó)Kendro Laboratory）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Step One Plus型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成大鼠miR-142-3p的反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR引物通過(guò)Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工有限公司合成。miR-145-3p、U6基因的反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR引物購(gòu)自Life Technology公司，miR-142-3p引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1　The base sequences of primers for quantitative real-time PCR and reverse transcription表1　反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR和反轉(zhuǎn)錄引物序列

1.4總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄取0.1 g組織樣品，于預(yù)冷的研缽中加液氮研磨組織至粉末，加入1 mL Trizol，按總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA?？俁NA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，將提取的RNA保存于-80℃?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.1總RNA中基因組DNA的去除2 μg總RNA，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O補(bǔ)加至10 μL，PCR儀中42℃2 min。

1.4.2cDNA的合成上述反應(yīng)液10 μL中加入1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5× PrimeScript Buffer 2，4μL RNase Free dH2O，總體積為20μL。混勻后37℃15 min，85℃5 s，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR按照Takara公司的（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)在Step One Plus熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL Probe Master，1 μL Primer Mix，1.5 μL cDNA模板，7.5 μL超純水。其中Primer Mix的配置方法：TaqMan探針（10 μmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmo/L）各7.5 μL，超純水9 μL。95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；并進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)組織樣品做3次平行試驗(yàn)，取其平均值，并在每批次實(shí)驗(yàn)中設(shè)陰性對(duì)照。采用2-ΔΔCt法分析表達(dá)量，2-ΔΔCt越大說(shuō)明miRNA在組織中的表達(dá)越強(qiáng)。ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕?Ct實(shí)驗(yàn)管家基因）-（Ct對(duì)照目的基因-Ct對(duì)照管家基因），計(jì)算得到ΔΔCt值后再計(jì)算2-ΔΔCt值。

1.6靶基因預(yù)測(cè)和GO（Gene Ontology）分析首先利用Target scan6.2預(yù)測(cè)miR-142-3p、miR-145-3p的靶基因，將預(yù)測(cè)出的靶基因分別映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）中，根據(jù)假陽(yáng)性率＜0.05和富集參數(shù)＞1.3，篩選出符合要求的基因本體分類(lèi)條目。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1總RNA提取結(jié)果總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示有28 S、18 S及5.8 S 3條帶，28S、18S條帶清晰；經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280=1.8～2.0，OD260/OD230＞2.0，表明RNA的濃度及完整性較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠 miR-142-3p組織表達(dá)譜分析大鼠miR-142-3p在各組織中的相對(duì)表達(dá)量（2- Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）從高到低分別為肝、乳腺、肺、心、脾、卵巢、子宮和腎，且乳腺中的表達(dá)量顯著高于心、脾、肺、腎、卵巢和子宮，僅次于肝中的表達(dá)量（F=327.748，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.3大鼠 miR-145-3p組織表達(dá)譜分析大鼠miR-145-3p在各組織中的相對(duì)表達(dá)量（2- Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）從高到低分別為心、乳腺、肺、子宮、卵巢、肝、脾和腎，且乳腺中的表達(dá)量顯著高于肝、脾和腎，而在心、肺、卵巢和子宮中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

Fig.1　Histograms showingthe relative expression differences of miR-142-3p in different tissues at day 21 of lactation圖1　泌乳21 d大鼠各組織中miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)差異圖

Fig.2　Histograms showingthe relative expression differences of miR-145-3p in different tissues at day 21 of lactation圖2　泌乳21 d大鼠各組織中miR-145-3p的相對(duì)表達(dá)差異圖

2.4大鼠miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳階段的相對(duì)表達(dá)譜（REP） 結(jié)果顯示，miR-142-3p的表達(dá)呈持續(xù)下降趨勢(shì)；miR-145-3p的表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)，見(jiàn)圖3。

Fig.3　Expression profiles of miR-142-3p and miR-145-3p in different lactation stages圖3　miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳階段的表達(dá)譜

2.5靶基因的預(yù)測(cè)和GO分析miR-142-3p的GO分析結(jié)果表明樣本在富集的功能上多集中于正調(diào)控大分子代謝過(guò)程、調(diào)控凋亡等；miR-145-3p的 GO分析結(jié)果表明樣本在富集的功能上多集中于正調(diào)控催化活性、突出神經(jīng)元、調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，見(jiàn)圖4。

Fig.4　GO analysis of miR-142-3p and miR-145-3p圖4　miR-142-3p和miR-145-3p GO分析圖

3　討論

乳腺的發(fā)育和泌乳是一個(gè)極其復(fù)雜、高度綜合的過(guò)程，不僅受到激素、蛋白的調(diào)控，同時(shí)受到細(xì)胞因子、miRNA等的調(diào)控。miRNA主要通過(guò)與靶基因結(jié)合來(lái)調(diào)控乳導(dǎo)管和腺泡的發(fā)育、乳腺上皮細(xì)胞的活性［9］和增殖分化、乳蛋白合成［10］及乳糖代謝［11］。

miR-142-3p與miR-145-3p預(yù)測(cè)的靶基因中，其中Prlr［6］、IRS1、β-酪蛋白基因（CSN2）［12］等已被證實(shí)在乳腺發(fā)育和泌乳中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-142-3p與miR-145-3p的表達(dá)在大鼠各組織中存在差異，miR-142-3p在大鼠的乳腺、肝中表達(dá)豐度較高，進(jìn)一步說(shuō)明miR-142-3p參與乳腺生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和乳脂的合成，這與李慧銘［6］的研究結(jié)果miR-142-3p通過(guò)靶向Prlr抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖和降低β-酪蛋白的分泌一致。miR-145-3p在乳腺、心、肺臟、卵巢和子宮中均高表達(dá)，表明其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能、呼吸系統(tǒng)等均起生物學(xué)作用，這與一個(gè)miRNA通過(guò)靶向多個(gè)靶基因，如髓細(xì)胞組織增生致癌基因（c-Myc）、八聚體結(jié)合蛋白-4（OCT4）等，參與多條信號(hào)通路途徑而發(fā)揮功能的結(jié)果相一致［13］。

Wang等［14］對(duì)小鼠乳腺不同發(fā)育階段miRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，乳腺每一個(gè)發(fā)育階段都有它自己的miRNA表達(dá)譜，即在乳腺中的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間特異性。miR-142-3p在泌乳1、7、21 d中表達(dá)下調(diào)。miR-142-3p通過(guò)抑制內(nèi)源性Prlr基因和蛋白的表達(dá)［6］，來(lái)調(diào)控mTOR和JAK2/STAT5信號(hào)通路，進(jìn)而抑制乳腺上皮細(xì)胞的活性、增殖能力及β-酪蛋白的分泌［15］。本研究中miR-142-3p在泌乳7 d的表達(dá)量急劇下降，說(shuō)明此時(shí)乳腺上皮細(xì)胞的活性、β-酪蛋白的分泌能力很強(qiáng)。Lei等［16］研究報(bào)道，miR-145通過(guò)抑制鈣離子相關(guān)的RhoA1蛋白（ROCK1）的mRNA來(lái)抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Guo等［7］研究顯示miR-145-5p通過(guò)靶向胰島素受體能抑制脂肪的形成。本研究表明，miR-145-3p在泌乳7 d表達(dá)量最低，泌乳21 d呈明顯上升，推測(cè)miR-145-3p與miR-145、miR-145-5p功能相同似。

綜上所述，miRNA在乳腺組織發(fā)育和泌乳中發(fā)揮重要作用，但對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，研究miRNA對(duì)正常乳腺發(fā)育和泌乳的調(diào)控具有重要意義，同時(shí)也為人類(lèi)乳腺疾病的診治提供新思路。

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（2015-08-20收稿2015-11-10修回）

（本文編輯李鵬）

The expression pattern of miR-142-3p and miR-145-3p in rat tissues

WU Hui，ZHAO Yulong，WANG Yanhong，F(xiàn)ANG Xingtang，CHEN Hong，ZHANG Chunlei
School of Life Science of Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China Corresponding AuthorE-mail:clzhang@jsnu.edu.cn

Abstract：ObjectiveTo screen and identify the key miRNAs during mammary gland development and milk secretion of rats.MethodsGene U6 was taken as interior label gene by real time-PCR to compare the differences of expression levels of miR-142-3p and miR-145-3p in the mammary gland，liver，heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus after 21 postpartum. Moreover，the expressions of miR-142-3p and miR-145-3p in different stages（1，7 and 21 d）of lactation were summarized. ResultsThere was significant difference in miR-142-3p in lactation 21 d between different tissues.The expression of miR-142-3p was significantly higher in mammary gland than that in heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus tissues，which was second only to the expression in liver（P＜0.05）.The expression of miR-145-3p was significantly higher in mammary gland than that in liver，spleen and kidney.There was no significant difference in the expression of miR-145-3p between heart，lung，ovary and uterus（P＞0.05）.Furthermore，the relative expression level of miR-142-3p was continuing downward continued to decline in breast at different stages of lactation，while the relative expression level of miR-145-3p was up-regulated after downregulating.ConclusionmiR-142-3p and miR-145-3p are differentially expressed in different tissues and physiological periods in rats.In addition，miR-142-3p can regulate the growth of mammary gland and the formation of lactation by targeting prolactin receptor（Prlr），miR-145-3p may have the same function with miR-145 and miR-145-5p.

Key words：mammary glands，animal；microRNAs；liver；heart；spleen；lung；kidney；ovary；uterus；rats，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；real time-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：R349.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150116

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31472077）

作者單位：江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（郵編221116）

作者簡(jiǎn)介：吳慧（1989），女，碩士研究生，主要從事乳腺分子生物學(xué)研究

通訊作者E-mail：clzhang@jsnu.edu.cn