于兆進(jìn)，江茜，韓麗，關(guān)舒，顏媛媛，魏敏杰，何苗△

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miR-100表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FZD-8表達(dá)的相關(guān)性研究

于兆進(jìn)1，江茜1，韓麗1，關(guān)舒2，顏媛媛1，魏敏杰1，何苗1△

摘要：目的考察臨床乳腺癌病理組織中miR-100和Wnt通路關(guān)鍵因子卷曲蛋白（FZD）-8表達(dá)之間的關(guān)系，并分析miR-100表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法選取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科術(shù)后的50例乳腺癌患者，通過原位雜交檢測(cè)乳腺癌患者病理組織及其配對(duì)的癌旁組織中miR-100的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)2種組織中FZD-8的表達(dá)；比較有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中miR-100表達(dá)情況，分析乳腺癌組織miR-100與FZD-8表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果miR-100在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于其配對(duì)的癌旁組織［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織中miR-100低表達(dá)［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00）］；與癌旁組織相比，F(xiàn)ZD-8在乳腺癌組織中高表達(dá)［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］，且其表達(dá)水平與miR-100的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.592，P＜0.001）。結(jié)論miR-100作為抑癌miRNA參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，可能與其調(diào)控FZD-8的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：乳腺腫瘤；淋巴轉(zhuǎn)移；Wnt蛋白質(zhì)類；微RNAs；miR-100；Wnt通路；卷曲蛋白8

△通訊作者E-mail：hemiao_cmu@126.com

Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的通路，參與細(xì)胞增殖、分化、生存、凋亡等細(xì)胞生物過程的調(diào)節(jié)［1］。卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)ZD）-8是Frizzled受體家族主要成員之一，在Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。已有研究證實(shí)miR-100靶向抑制同源基因（HOX）A1，可進(jìn)而抑制腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［3］。但是，關(guān)于miR-100與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系有待深入研究。本研究檢測(cè)了臨床乳腺癌患者病理組織中miR-100和FZD-8的表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性，以及miR-100表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在探討miR-100介導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料50例乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁組織，來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科病房2011年1月—2012年12月間實(shí)施手術(shù)的女性乳腺癌患者，年齡34～72歲，平均（47.6±11.8）歲；收集經(jīng)病理診斷明確的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，其中乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例；患者術(shù)前均未接受放療或化療?？贵wFZD-8購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；SP超敏濃縮試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；地高辛標(biāo)記的miR-100寡核苷酸探針由上海生工生物工程股份有限公司合成；原位雜交檢測(cè)試劑盒（Enhanced Sensitive ISH Detection KitⅡ）購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色乳腺癌組織微陣列芯片經(jīng)二甲苯脫蠟，降梯度乙醇脫苯、水化。將芯片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），高壓修復(fù)8～10 min。3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；正常山羊血清封閉；PBS稀釋的一抗FZD-8（1∶200）4℃孵育過夜。次日芯片經(jīng)生物素標(biāo)記的二抗（1∶200）37℃孵育30 min；鏈霉素抗生物素-辣根過氧化物酶（1∶200）37℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB溶液顯色。蘇木素復(fù)染。脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察。同步操作陰性對(duì)照，即癌旁組織，采用PBS液代替一抗。

1.2.2原位雜交組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯、水化；3%過氧化氫處理10 min；蛋白酶K（20 mg/L）37℃孵育15 min；預(yù)雜交液中37℃預(yù)雜交2 h；雜交液中37℃雜交過夜。10%正常山羊血清37℃孵育30 min；生物素標(biāo)記的鼠抗地高辛37℃孵育60 min；SABC-AP 37℃孵育30 min。蘇木素復(fù)染等步驟同上。

1.2.3結(jié)果判定miR-100及FZD-8表達(dá)均按著色細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度兩者記分乘積計(jì)分。著色細(xì)胞百分率：＜5%染色記為0，5%～25%染色記為1，26%～50%染色記為2，51%～75%染色記為3，＞75%染色記為4。染色強(qiáng)度：無染色記為0，弱陽性記為1，中等強(qiáng)度記為2，強(qiáng)陽性記為3。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，因miR-100及FZD-8表達(dá)評(píng)分為非正態(tài)分布的連續(xù)變量，采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，兩組間miR-100及FZD-8表達(dá)水平比較采用Mann-Whitney U test分析；采用Spearman相關(guān)系數(shù)來描述miR-100及FZD-8表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-100在乳腺癌組織中的表達(dá)原位雜交結(jié)果顯示，miR-100在癌組織中染色程度與癌旁組織相比明顯減弱，見圖1。癌組織中miR-100表達(dá)水平顯著低于癌旁組織［2.00（1.00，3.00）vs.6.00 （3.50，8.00），Z=5.235，P＜0.001］。

Fig.1　Figures showingmiR-100 expression in breast cancer tissues and adjacent normal tissues measured by in situ hybridization（ISH，×200）圖1　乳腺癌患者癌組織及癌旁組織中miR-100的表達(dá)（原位雜交，×200）

2.2乳腺癌組織中miR-100表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中miR-100表達(dá)水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00），Z=3.041，P=0.002］。

2.3乳腺癌組織中FZD-8與miR-100的相關(guān)性免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD-8在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00），Z=3.201，P=0.001］，見圖2。相關(guān)分析顯示FZD-8與miR-100表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.592，P＜0.001）。

Fig.2　Figures showingthe expression of FZD-8 in human breast cancer tissues and adjacent normal tissues analyzed by immunohistochemistry（IHC，×200）圖2　乳腺癌患者癌組織及癌旁組織中FZD-8的表達(dá)（免疫組化，×200）

3　討論

3.1miR-100與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系侵襲轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預(yù)后不良、引起死亡的最主要原因，因此尋找抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)勢(shì)在必行。miRNA是一類長(zhǎng)度約為21～23個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，在多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)控作用。一些miRNAs已被發(fā)現(xiàn)作為抑癌基因在抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Nishikawa等［4］報(bào)道m(xù)iR-29可直接靶向laminin信號(hào)在前列腺癌中抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。有研究報(bào)道m(xù)iR-100在口腔癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌和膀胱癌中低表達(dá)［5-7］。Gebeshuber等［8］報(bào)道m(xù)iR-100能靶向抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子2的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的進(jìn)展。最近，Chen等［9］也報(bào)道了miR-100通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)polo樣激酶1（PLK1）表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。Petrelli等［10］也證實(shí)了miR-100通過抑制PLK1抑制了乳腺癌干細(xì)胞干性的維持。本研究通過原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-100在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中低表達(dá)，提示其可能作為抑癌miRNAs抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

3.2miR-100與FZD-8表達(dá)的關(guān)系腫瘤細(xì)胞所處微環(huán)境中復(fù)雜的信號(hào)通路，如Wnt、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β、Notch等信號(hào)通路的相互作用介導(dǎo)了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程［11］。當(dāng)Wnt在細(xì)胞膜表面與FZD和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5/6結(jié)合后，激活經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt通路，抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）-軸蛋白（AXIN）-腺瘤狀結(jié)腸息肉蛋白（APC）-糖原合成酶激酶（GSK）3β復(fù)合物的形成，增加β-catenin的穩(wěn)定性與入核，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］，可見Wnt信號(hào)通路的激活在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。一些miRNAs被證實(shí)能夠靶向調(diào)節(jié)Wnt通路的關(guān)鍵因子，從而參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)miR-612可通過抑制Wnt信號(hào)通路來抑制肝癌細(xì)胞的干性、侵襲和遷移［13］。Subramanian等［14］研究顯示miR-29通過下調(diào)β-catenin的共激活子的表達(dá)，抑制腸癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的功能。FZD-8為Wnt信號(hào)通路受體卷曲蛋白家族中的一員，在Wnt通路活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)FZD-8在三陰性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制FZD-8的表達(dá)能夠抑制Wnt通路的活性，并明顯增加三陰性乳腺癌細(xì)胞的藥物敏感性［15］。而本研究是在乳腺癌病理組織中進(jìn)行FZD-8表達(dá)水平檢測(cè)，且未考慮乳腺癌三陰性分子表型，亦發(fā)現(xiàn)FZD-8在乳腺癌中高表達(dá)，這提示乳腺癌中FZD-8并非三陰性表型者獨(dú)有的標(biāo)志分子，這可在更大樣本的組織標(biāo)本中進(jìn)行FZD-8檢測(cè)予以進(jìn)一步確認(rèn)。本研究通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FZD-8在臨床乳腺癌患者病理組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且其表達(dá)與miR-100的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-100和FZD-8有望成為評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，靶向FZD-8可能為臨床乳腺癌的治療提供重要線索。

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（2015-11-25收稿2016-03-02修回）

（本文編輯李鵬）

The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis and FZD-8 protein expression in patients with breast cancer

YU Zhaojin1，JIANG Qian1，HAN Li1，GUAN Shu2，YAN Yuanyuan1，WEI Minjie1，HE Miao1
1 Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；2 Department of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of China Medical University Corresponding AuthorE-mail：hemiao_cmu@126.com

Abstract：ObjectiveTo evaluate the expression and relationship of miR-100 and FZD-8，one of the major components of Wnt signaling pathway，and the correlation of their expressions with lymph node metastasis in patients with breast cancer.MethodsThe expression of miR-100 was determined in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by in situ hybridization.The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis was analyzed by Mann-Whitney U test.The expression of FZD-8 was measured in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by immunohistochemistry.The correlation of the miR-100 expression with the protein expression of FZD-8 was evaluated by Pearson rank analysis.ResultsThe expression of miR-100 was significantly lower in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］.The miR-100 expression was lower in patients with lymph node metastasis than that in patients without lymph node metastasis［1.50（1.00，2.75）vs.3.00 （2.00，4.00）］.The expression of FZD-8 was significantly higher in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］.The miR-100 expression was negatively correlated with the FZD-8 protein expression in human breast cancer tissues（rs=-0.592，P＜0.001）.ConclusionThe miR-100，as an anti-metastasismiRNA，may involve in the metastasis of breast cancer，which may be related with the regulation of the expression of FZD-8.

Key words：breast neoplasms；lymphatic metastasis；Wnt proteins；microRNAs；miR-100；Wnt pathway；FZD-8

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150333

基金項(xiàng)目：遼寧省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（LT2014016）；沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F14-232-6-05）

作者單位：1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室（郵編110122）；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院乳腺外科

作者簡(jiǎn)介：于兆進(jìn)（1983），男，講師，碩士，主要從事分子腫瘤藥理學(xué)研究