奚曉青，陳小真，馬全鑫，張利棕，方明筍，陳 誠，蔡月琴，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

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主動脈弓狹窄致大鼠慢性心力衰竭模型的建立及病理過程觀察

奚曉青，陳小真，馬全鑫，張利棕，方明筍，陳 誠，蔡月琴，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

【摘要】目的 觀察主動脈弓狹窄致大鼠心力衰竭的病理過程變化。方法 沿胸骨剪斷大鼠左側(cè)第二根肋骨開胸，于頭臂干和左頸總動脈之間行主動脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction，TAC）建立慢性心力衰竭模型24只，另取大鼠8只行假手術(shù)。假手術(shù)組于術(shù)后12周，模型組分別在TAC術(shù)后4周、8周、12周時進(jìn)行超聲心動、血流動力學(xué)檢測和N端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）測定，并進(jìn)行心肌組織病理學(xué)觀察。結(jié)果 模型組在TAC術(shù)后4周時NT-proBNP顯著增加、8周達(dá)到峰值（P＜0.05）、12周時呈下降趨勢；超聲心動圖結(jié)果顯示，模型組TAC術(shù)后4周時射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、短軸率（fraction shortening，F(xiàn)S）顯著升高、左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）顯著減?。≒＜0.05），8周時EF顯著升高（P ＜0.05），12周時EF顯著降低、左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、LVESV顯著增加（P＜0.05）；血流動力學(xué)檢測顯示，模型組在TAC術(shù)后左室最大收縮速率（left ventricular pressure maximal rate of rise，dp/dtmax）降低、左室最大舒張速率（left ventricular pressure maximal rate of fall，-dp/dtmax）升高（P＜0.05）；病理學(xué)觀察顯示，模型組TAC術(shù)后4周時心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，8周時心肌間結(jié)締組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤，12周時心肌細(xì)胞凋亡、膠原纖維沉積。結(jié)論 主動脈弓狹窄致大鼠心力衰竭模型在TAC術(shù)后4周時心肌出現(xiàn)代償性肥厚，8周時心肌出現(xiàn)失代償?shù)某跗诜磻?yīng)，12周時出現(xiàn)心肌纖維化，形成不可逆的心力衰竭。

【關(guān)鍵詞】慢性心力衰竭；主動脈弓狹窄；病理過程；大鼠

心力衰竭是各種心臟疾病致心功能不全的臨床綜合征，也是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿。目前全球心力衰竭患者的數(shù)量已高達(dá)2250萬，并且以每年200萬的速度快速遞增，心力衰竭的高患病率和高死亡率使它成為一個全球性難題［1］。主動脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction，TAC）致左室肥厚模型與人類心力衰竭病理過程類似，是一種理想的動物模型［2］。但目前各類文獻(xiàn)報道TAC術(shù)后形成心力衰竭的進(jìn)程不一［3，4］，且心力衰竭各個時期的病理特點尚不明確。因此，本文對主動脈弓縮窄致大鼠心力衰竭的病理過程進(jìn)行了觀察和分析。

1　材料和方法

1.1實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級雄性SD大鼠40只，體重220～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK（滬）2012 -0002】；實驗動物使用許可證：【SYXK（浙）2013-184】，環(huán)境溫度：（22±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12 h/12 h明暗交替；每籠3只飼養(yǎng)，自由飲食；并按實驗動物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

異氟烷，購自深圳市華寶醫(yī)療用品工貿(mào)發(fā)展有限公司；烏拉坦，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；大鼠 N端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）ELISA試劑盒，購自杭州誠維生物有限公司。

小動物麻醉呼吸機（美國 Hallowell公司），Vevo2100小動物超聲影像系統(tǒng)（加拿大 Visual Sonics公司），MPA2000生理信號記錄儀（上海奧爾科特生物科技有限公司），Thermo光譜掃描多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），Nano Zoomer2.0RS數(shù)字切片掃描設(shè)備（日本濱松公司）。

1.3實驗方法

取雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，行主動脈弓狹窄手術(shù)［5，6］。術(shù)前禁食不禁水10 h～12 h，將大鼠誘導(dǎo)麻醉后，剃掉胸部被毛，并固定于45°斜式固定臺，進(jìn)行氣管插管，然后將動物固定于保溫臺，外接小動物麻醉呼吸機輔助呼吸。碘伏消毒胸部術(shù)區(qū)，剪斷大鼠左側(cè)第二根肋骨逐層開胸，并用撐開器撐開切口，充分暴露胸腺，依次分離胸腺、主動脈弓，用3-0號縫線包繞過主動脈弓后壁，從頭臂干和左頸總動脈之間探出。將外徑為0.9 mm的自制“L”型針平行置于主動脈弓上方，結(jié)扎后將“L”型針緩慢取出，逐層關(guān)閉胸腔，消毒切口。術(shù)后3 d肌肉注射100 000U青霉素，并每天觀察動物狀況。另取大鼠8只行假手術(shù)，其它步驟相同但不縮窄主動脈弓。將術(shù)后存活大鼠模型24只，分別在TAC術(shù)后4周、8周、12周時各取8只，進(jìn)行超聲心動、血流動力學(xué)檢測。檢測結(jié)束后，取血分離血清，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中NT-proBNP的含量，并進(jìn)行心肌組織病理學(xué)觀察。

1.4指標(biāo)觀察

1.4.1小動物超聲心動圖的測定：模型組在TAC術(shù)后4周、8周、12周時各取8只，假手術(shù)組術(shù)后12周時，進(jìn)行超聲心動圖檢測，具體方法：將大鼠進(jìn)行異氟烷吸入麻醉后，仰臥固定，用高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)，探頭頻率21 MHz，取左胸骨旁的短軸切面，在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲心動圖，分別測量左室舒張末期室間隔厚度（left ventricular end-diastolic interventricular septal thickness，IVSd）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVIDd）、左室后壁舒張末期厚度（left ventricularend-diastolicposteriorwallthickness，LVPWd）、左室收縮末期室間隔厚度（left ventricular end-systolic interventricular septal thickness，IVSs）、左室收縮末期內(nèi)徑 （leftventricularend-systolic diameter，LVIDs）、左室后壁收縮末期厚度（left vebtricularend-systolicposteriorwallthickness，LVPWs），計算射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、短軸率（fraction shortening，F(xiàn)S）、左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV），在連續(xù)3個心動周期上測量各指標(biāo)并取其平均值。

1.4.2血流動力學(xué)各項指標(biāo)的測定：腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠（5 mL/kg），將微型導(dǎo)管連接壓力換能器經(jīng)右頸總動脈進(jìn)行插管，另一端連接生理信號記錄儀。當(dāng)微型導(dǎo)管進(jìn)入左心室后，穩(wěn)定5 min再測量左室收縮末壓（left ventricular endsystolic pressure，LVESP）、左室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大收縮速率（left ventricular pressure maximal rate of rise，+dp/dtmax）、左心室最大舒張速率（left ventricular pressure maximal rate of fall，-dp/dtmax）等血流動力學(xué)指標(biāo)。

1.4.3病理組織學(xué)檢測：檢測結(jié)束后，處死動物，開胸取心臟，經(jīng)4%甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1TAC大鼠的存活率及并發(fā)癥

我們在實驗中觀察到，主動脈弓縮窄術(shù)術(shù)中及術(shù)后死亡原因主要是主動脈弓破裂、結(jié)扎過緊形成急性心肌缺血、肺部損傷導(dǎo)致呼吸不暢。手術(shù)操作過程中及術(shù)后24 h內(nèi)死亡3只，成活29只，存活率約為90.6%；術(shù)后3 d內(nèi)死亡2只，存活27只，存活率為84.4%；術(shù)后4周，死亡2只，存活25只，存活率為78.1%。術(shù)后4周，假手術(shù)組死亡0只，存活8只動物。

2.2TAC術(shù)后不同時期大鼠血清NT-proBNP水平變化

與假手術(shù)組相比，模型組TAC術(shù)后4周、8周時血清NT-proBNP顯著增加（P＜0.05），且8周時血清NT-proBNP達(dá)到峰值；12周時血清NT-proBNP降低，與假手術(shù)組比較無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.3TAC術(shù)后不同時期大鼠的超聲心動圖變化

與假手術(shù)組比較，模型組 TAC術(shù)后4周時IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs顯著增厚（圖1）、LVIDs顯著減小、計算值EF、FS顯著升高、LVESV顯著降低（P＜0.05）。8周時IVSd、IVSs、LVPWs顯著增厚、計算值EF顯著升高（P＜0.05）。12周時IVSs顯著增厚、LVIDd和LVIDs顯著增加、計算值EF顯著降低、LVEDV和LVESV顯著擴增（P＜0.05）（表2）。

與模型組TAC術(shù)后4周比較，8周時各項指標(biāo)差異無顯著性（P＞0.05）。與TAC術(shù)后4周、8周比較，12周時LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV顯著增加、LVPWs顯著變?。≒＜0.05），EF和FS顯著降低（P＜0.05）（表2）。

2.4TAC術(shù)后不同時期大鼠的血流動力學(xué)變化

與假手術(shù)組比較，模型組TAC術(shù)后4周時 + dp/dtmax顯著降低、-dp/dtmax顯著升高（P＜0.05）。8周時HR、LVESP、+dp/dtmax顯著降低、-dp/dtmax顯著升高（P＜0.05）。12周時HR、+ dp/dtmax顯著降低、-dp/dtmax顯著增高（P＜0.05）。

與模型組TAC術(shù)后4周比較，8周時HR、+dp/ dtmax顯著降低（P＜0.05）。與TAC術(shù)后4周和8周比較，12周時HR顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表1　TAC術(shù)后不同時期大鼠NT-proBNP水平變化（±s）Tab.1 Changes of serum NT-proBNP levels of the rats at different time points after transverse aortic constriction

表1　TAC術(shù)后不同時期大鼠NT-proBNP水平變化（±s）Tab.1 Changes of serum NT-proBNP levels of the rats at different time points after transverse aortic constriction

注：*：與假手術(shù)組相比，P＜0.05。Note.*：Compared with the sham-operation group，P＜0.05.

組 別Groups假手術(shù)組Sham-operation group TAC 4周TAC 4 weeks TAC 8周TAC 8 weeks TAC 12周TAC 12 weeks N端前腦鈉素NT-proBNP（pg/mL）　357.63±60.60　511.39±66.12*　542.33±166.39*　438.84±41.72

圖1　TAC術(shù)后不同時期大鼠的超聲心動圖Note.A：Sham-operation group；B：TAC 4 weeks；C：TAC 8 weeks；D：TAC 12 weeksFig.1 Echocardiographic assessment of the rats at different time points after transverse aortic constriction

2.5TAC術(shù)后不同時期大鼠的心肌組織病理學(xué)變化

通過HE染色可見，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊清晰，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，閏盤呈深紅色線狀，形如階梯，橫貫心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞之間有薄層結(jié)締組織。模型組TAC術(shù)后4周時心肌細(xì)胞肥大、肌纖維增粗，細(xì)胞核增大，排列紊亂，血管外膜結(jié)締組織增生，邊緣心肌纖維間炎癥細(xì)胞浸潤并向心擴散。8周時心肌細(xì)胞排列雜亂，胞質(zhì)明顯增多，心肌細(xì)胞之間無明顯界限，心肌纖維外的成纖維細(xì)胞增多，大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管基膜增厚，管腔狹窄。12周時，大量心肌細(xì)胞凝固性壞死并伴有空泡變性，部分心肌組織消失（圖2）。

通過Masson染色可見，假手術(shù)組與TAC術(shù)后4周模型的心肌組織中未見膠原纖維著色，8周時心肌邊緣染色異常，12周時膠原纖維沉積，大面積心肌呈現(xiàn)藍(lán)色（圖2）。

3　討論

本實驗用主動脈弓縮窄術(shù)（TAC）致大鼠心力衰竭，在TAC術(shù)后4周出現(xiàn)心肌肥大，8周出現(xiàn)心肌失代償初期反應(yīng)，12周時心肌出現(xiàn)不可逆的心力衰竭，呈現(xiàn)漸行性心衰過程，符合臨床還原壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌代償性肥大到失代償性心力衰竭病理生理發(fā)展過程。

NT-proBNP主要來源于心室，其釋放與心室擴張和壓力超負(fù)荷相關(guān)聯(lián)［7，8］，現(xiàn)作為心臟功能不全的標(biāo)志物，主要用于心力衰竭的臨床診斷、療效評價和預(yù)后判斷。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組TAC術(shù)后+dp/dtmax顯著降低、-dp/dtmax升高，并出現(xiàn)TAC術(shù)后4周時血清NT-proBNP顯著升高，術(shù)后8周時血清NT-proBNP達(dá)到峰值，提示長期的血流動力學(xué)負(fù)荷導(dǎo)致心肌功能嚴(yán)重障礙。但本模型在TAC術(shù)后12周時出現(xiàn)血清NT-proBNP減少，與臨床現(xiàn)象有一定差異［9］，這可能與心肌細(xì)胞大面積凋亡有關(guān)。進(jìn)一步病理檢測發(fā)現(xiàn)TAC術(shù)后12周心肌細(xì)胞大面積凋亡、壞死，而NT-proBNP主要來源于心室，推測在TAC術(shù)后12周時，可能由于心肌細(xì)胞大面積凋亡、壞死而導(dǎo)致NT-proBNP分泌減少。

超聲心動圖為慢性心力衰竭重要的檢查手段，能為測評心力衰竭的嚴(yán)重程度提供依據(jù)。本實驗結(jié)果顯示模型組TAC術(shù)后4周時左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、室間隔收縮末期厚度（IVSs）、室間隔舒張末期厚度（IVSd）顯著增厚，左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）顯著縮小，射血分?jǐn)?shù)（EF）顯著升高。表明TAC術(shù)后4周時各室壁增厚，心室腔減小，心臟收縮舒張功能受損，心肌形成代償性肥厚。代償性心肌肥厚在最初是有益的，因為它補償了心肌梗死后功能的喪失［10］。但長時間的血流動力學(xué)負(fù)荷，自適性心肌肥大的心室半徑增加，室壁壓力增加，心室需氧量也增加，最終導(dǎo)致心臟功能障礙［11］，形成不可逆的心力衰竭。在TAC術(shù)后8周時各指標(biāo)變化有所緩解，提示心肌可能出現(xiàn)失代償?shù)某跗诜磻?yīng)，各心室壁無進(jìn)一步增厚，但心功能進(jìn)一步受損。在TAC術(shù)后12周時，LVIDs、LVIDd、IVSs、IVSd相較于4周、8周而言變薄，LVEDV、LVESV顯著擴增，EF顯著降低，與文獻(xiàn)報道［12］一致。表明在TAC術(shù)后12周時慢性心力衰竭已發(fā)展至完全失代償。

心肌組織病理學(xué)顯示TAC術(shù)后4周心肌細(xì)胞橫截面積增加，細(xì)胞核增大，其心肌增厚情況與超聲心動圖顯示結(jié)果一致。8周時，成纖維細(xì)胞增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤，屬于心肌肥厚的病變表現(xiàn)。12周時，心肌細(xì)胞凝固性壞死，心肌間質(zhì)膠原纖維沉

表3　TAC術(shù)后不同時期大鼠左心室心功能變化（±s）Tab.3 The left heart function in the rats at different time points after transverse aortic constriction

表3　TAC術(shù)后不同時期大鼠左心室心功能變化（±s）Tab.3 The left heart function in the rats at different time points after transverse aortic constriction

注：a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與TAC 4周比較，P＜0.05；c：與TAC 8周比較，P＜0.05。Note.a：Compared with the sham-operation group，P＜0.05；b：Compared with the TAC 4 weeks，P＜0.05；c：Compared with the TAC 8 weeks，P＜0.05.

左室最大舒張速率-dp/dtmax （mmHg/s）假手術(shù)組Sham-operation group　430±19　156.48±14.690　0.5±1.84　12202.36±1657.41　-8321.67±663.6 TAC 4周TAC 4 weeks　396±69　171.69±60.78　-0.19±3.26　8108.81±2659.23a　-6771.49±1648.45a組別Groups心率HR（bpm）左室收縮末期壓LVESP （mmHg）左室舒張末期壓LVEDP （mmHg）左室最大收縮速率+dp/dtmax （mmHg/s）TAC 8周TAC8 weeks　286±27a，b　130.21±10.28a　1.85±4.20　5825.33±650.54a，b　-5405.21±902.70aTAC 12周TAC 12 weeks　245±5a，b，c　132.00±25.43　-2.52±2.45　5220.13±1618.03a　-5425.97±1521.11a

圖2　不同時期大鼠心肌組織的HE染色與Masson染色Fig.2 Morphological changes of the rat myocardium at different time points.H&E staining and Masson's staining

積，心肌嚴(yán)重纖維化，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降，形成不可逆的心力衰竭。

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〔修回日期〕2016-01-12

Establishment of a rat model of chronic heart failure by transverse aortic constriction and observation of its pathological process

XI Xiao-qing，CHEN Xiao-zhen，MA Quan-xin，ZHANG Li-zong，F(xiàn)ANG Ming-sun，CHEN Cheng，CAI Yue-qin，CHEN Min-li
（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

【Abstract】Objective To observe the pathological changes of heart failure caused by transverse aortic constriction in rats.Methods Partial thoracotomy was performed to the second rib and the transverse aortic constriction was performed between the innominate and left carotid arteries to establish a model of heart failure in 24 rats.The same operation was performed on another 8 rats，except for the ligation of the transverse aorta.Echocardiographic assessment，hemodynamic measurement，myocardial histopathological examination and NT-proBNP measurement were performed to the sham group at12 weeks and model group at 4 weeks，8 weeks，12 weeks after the operation.Result At 4 weeks after the operation，NT-proBNP，EF，F(xiàn)S and-dp/dtmax of the model group was significantly increased and LVESV，+dp/dtmax of the model group were significantly decreased（P＜0.05）.At 8 weeks after the operation，EF and-dp/dtmax of the model group were increased and+dp/dtmax of the model group was significantly decreased（P＜0.05）.At 12 weeks after the operation，NT-proBNP，EF and+dp/dtmax of the model group were decreased，and LVESV，LVEDV and-dp/dtmax of the model group were increased（P＜0.05）.The cardiomyocytes became hypertrophic and lined up in disorder at 4 weeks after the operation.Pathologic examination of the myocardial tissue showed connective tissue proliferation and inflammatory cell infiltration at 8 weeks after the operation，and cardiomyocyte apoptosis and collagen fiber deposition at 12 weeks after the operation.Conclusions Transverse aortic constriction induces heart failure in rats.The pathological processes are compensatory hypertrophy at 4 weeks after the operation，initial reaction of decompensation at 8 weeks after the operation，and heart failure at 12 weeks after the operation.

【Key words】Chronic heart failure；Transverse aortic constriction；Pathological process；Rats

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0035-06

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.006

［基金項目］國家衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金（編號：2016149056）；比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團隊（編號：XTD201301）。

［作者簡介］奚曉青（1990-），女，碩士生，研究方向：中藥藥理與比較醫(yī)學(xué)，E-mail：xixiaoqing163@163.com。

［通訊作者］陳民利（1963-），女，教授、碩士，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，E-mail：cmli991@aliyun.com。