鐘　研，李金林，陳良君，楊占秋

(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所,病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430071)

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漢灘病毒包膜糖蛋白假病毒的構(gòu)建及特性研究

鐘研，李金林，陳良君，楊占秋

(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所,病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430071)

【摘要】目的：研究漢灘病毒包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞作用的分子機(jī)制，構(gòu)建含有漢灘病毒(HTNV)標(biāo)準(zhǔn)株76～118株包膜糖蛋白的假病毒,并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè). 方法：將表達(dá)漢灘病毒包膜糖蛋白的質(zhì)粒和以VSVΔG為骨架的假病毒顆粒，與293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，構(gòu)建漢灘病毒的假病毒，用中和實(shí)驗(yàn)，受體抑制實(shí)驗(yàn)，免疫共沉淀和Western Blot對(duì)其抗原性、中和反應(yīng)、受體作用等進(jìn)行檢測(cè). 結(jié)果：漢灘病毒假病毒與活病毒有相似的抗原特性，漢灘病毒假病毒可以模擬活病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式，其糖蛋白是以二聚體形式存在的. 結(jié)論：成功構(gòu)建含有漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株包膜糖蛋白的假病毒，它與活病毒的抗原特性和受體作用的方式相似，這為進(jìn)一步研究漢灘病毒包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞作用的分子機(jī)制提供了很好的工具.

【關(guān)鍵詞】漢灘病毒；包膜糖蛋白；假病毒；水泡性口炎病毒

0引言

漢坦病毒屬于布尼亞病毒科，主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和肺綜合征出血熱(hantavirus pulmonary symdrome， HPS)兩種疾病[1]. 包括我國(guó)在內(nèi)的亞洲地區(qū)主要以漢灘病毒(hantaan virus， HTNV)和漢城病毒(seoul virus， SEOV)引起的HFRS為主，歐洲地區(qū)以普馬拉型(puumala virus，PUUV)，多布拉伐型(dobrava virus，DOBV)引起的HFRS為主，美洲地區(qū)主要由辛諾柏病毒(sin nombre virus，SNV)引起的HPS為主[2]. 漢坦病毒為單負(fù)鏈RNA病毒，由 L,M,S三個(gè)片段組成，L片段編碼病毒的RNA聚合酶，M片段編碼包膜糖蛋白(GN和GC)，S片段編碼核殼蛋白(NP). 其中包膜糖蛋白對(duì)病毒感染早期入胞，膜融合，晚期出胞等階段均具有重要作用，但其與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制仍未完全明了，需要進(jìn)一步研究. 目前，利用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)為骨架構(gòu)建的假病毒系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究RNA病毒的復(fù)制,外源糖蛋白的功能以及篩選藥物，疫苗評(píng)價(jià)等[3-7]，假病毒系統(tǒng)也已開始運(yùn)用于漢坦病毒的研究[2,8-9]. 但是這些假病毒是否能完全模擬漢坦病毒的生物學(xué)活性及功能尚未見報(bào)道. 本研究制備了以水泡性口炎病毒為骨架的漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株的假病毒，為深入研究漢坦病毒包膜糖蛋白與宿主相互作用機(jī)制及評(píng)價(jià)抗病毒藥物和疫苗效果提供手段.

1材料和方法

1.1材料漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株76～118株活病毒由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存. 293T細(xì)胞；Vero-E6細(xì)胞；Opti-MEM/LF2000(Invitrogen)，賓夕法尼亞大學(xué)的Robert Doms教授和Connie S.Schmaljohn 實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送了抗VSV-G和抗HTNV Gc的單克隆抗體HCO2和11E10. 新墨西哥大學(xué)醫(yī)院和智利的漢坦病毒研究組分別提供了抗SNV血清和抗ANDV的患者血清. 田納西大學(xué)的Michael Whitt教授和Robert Doms教授分別贈(zèng)送了VSVΔG-GFP-VSVG和VSVΔG-luc-VSVG假病毒,pCMV-VSV-G質(zhì)粒. 中質(zhì)粒提取試劑盒(Omega). FLAG肽，M2抗 FLAG 抗體(Sigma).

1.2方法

1.2.1漢灘病毒包膜蛋白質(zhì)粒的表達(dá)根據(jù)漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株M片段的基因序列，對(duì)編碼區(qū)的密碼子優(yōu)化之后，由公司(Menlo Park， CA，USA) 合成相應(yīng)的序列，其含有KpnI和NotI酶切位點(diǎn)，以此酶切位點(diǎn)將M片段克隆到真核表達(dá)載體 pCDNA3.1中，形成表達(dá)漢坦病毒包膜糖蛋白的質(zhì)粒，同時(shí)在GC蛋白的C末端加入了FLAG標(biāo)簽便于檢測(cè) .

1.2.2質(zhì)粒擴(kuò)增鑒定①將pHTNVMDNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增. 將連接好的質(zhì)粒熱休克后加入37℃預(yù)熱的300 μLLB培養(yǎng)基(不含抗生素)輕輕混勻，然后固定到搖床上37℃震蕩1 h，取上述轉(zhuǎn)化混合液200 uL滴到含合適抗生素的固體LB培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌玻璃棒涂布均勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜. 挑取固體培養(yǎng)基上的白色單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 g振蕩培養(yǎng)過夜. 取培養(yǎng)物離心后，試劑盒提取質(zhì)粒. ②用KpnI和NotI雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定質(zhì)粒.

1.2.3假病毒的制備①接種293T細(xì)胞到6孔板中，待細(xì)胞80%左右融合后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；②按LF2000說明書將LF2000與Opti-MEM，漢灘病毒表達(dá)質(zhì)粒與Opti-MEM液分別混勻稀釋，然后再將兩種稀釋液混合均勻，室溫放置5 min；③將96孔板換新鮮培養(yǎng)基，然后將混合轉(zhuǎn)染液輕輕的滴入到平皿中，繼續(xù)培養(yǎng)6 h；④6 h后，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基以減少LF2000對(duì)細(xì)胞的毒性，加入新鮮的培養(yǎng)基(不含抗生素)到6孔板中；⑤繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，將VSVΔG-GFP或VSVΔG-rLuc加入到DMEM原液中稀釋，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加入VSVΔG病毒稀釋液，37℃孵育2 h后，去除病毒稀釋液，用DMEM 原液洗細(xì)胞兩次，然后加入不含抗生素的2%DMEM的培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h；⑥從6孔板中收取上清到離心管后，2000 rpm，10 min離心，收取上清,然后加入Tris；⑦用濾器過濾后，分裝，待用.

1.2.4假病毒對(duì)VeroE6細(xì)胞的感染性的檢測(cè)①將veroE6細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到單層后開始實(shí)驗(yàn)；②將制備好的帶有Luciferase標(biāo)簽的假病毒按照不同濃度進(jìn)行稀釋后感染VeroE6細(xì)胞，孵育2 h；③棄去病毒液，用DMEM原液洗一遍，然后加入含2% DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)16 h；④檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Luciferase的量(RLU)即可反映假病毒對(duì)VeroE6細(xì)胞的感染性.

1.2.5血清或抗體對(duì)假病毒的中和作用的檢測(cè)①將veroE6細(xì)胞接種到96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)到單層后開始實(shí)驗(yàn)；②先將Anti-VSV抗體mAb VSV稀釋到1 μg/mL，1∶50稀釋倍數(shù)稀釋患者血清，然后將帶GFP標(biāo)簽的假病毒與血清或抗體稀釋液等體積混合，37℃水浴1 h；③將混合液加入細(xì)胞孔板中，培養(yǎng)24 h；④將培養(yǎng)液上清吸入EP管中，用胰酶消化細(xì)胞，將消化的細(xì)胞吸入到相應(yīng)上清的EP管中；⑤1000 rpm，10 min離心后去除上清液，加入200 μL的稀釋液混勻；⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染假病毒細(xì)胞的量.

1.2.6抗β3整合素受體藥物Reopro對(duì)漢灘病毒假病毒的抑制作用①將Vero-E6細(xì)胞接種到96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)到單層后開始實(shí)驗(yàn)；②將Reopro藥物用DMEM原液倍比稀釋后分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中50 μL/孔，孵育1 h；③將帶GFP的假病毒稀釋后加入等體積假病毒稀釋液到細(xì)胞培養(yǎng)孔，孵育1 h；④去除孵育液，洗2遍后，加入2% DMEM 細(xì)胞維持液，37℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)16 h；⑤在熒光顯微鏡下計(jì)算GFP 陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù).

1.2.7用免疫共沉淀方法檢測(cè)包膜糖蛋白是否以二聚體形式存在①將已制備好的漢灘病毒假病毒顆粒VSVG-luc用辛基糖苷裂解，然后用包被有抗 FLAG 的珠子進(jìn)行免疫共沉淀，②沉淀洗脫后用抗FLAG 和抗GN抗體進(jìn)行Western Blot試驗(yàn).

2結(jié)果

2.1漢灘病毒假病毒質(zhì)粒的鑒定用KpnI和NotI酶進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳跑出的片段與設(shè)計(jì)的質(zhì)粒片段相符(圖1). 漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株76～118 M片段質(zhì)粒M片段長(zhǎng)3616 bp,pCDNA3.1(-)為5428/5427 bp,總長(zhǎng)度約為9044 bp，條帶K+N為雙酶切條帶，共有4個(gè)條帶，分別大概位置在3600 bp,5400 bp,9000 bp,11 000 bp左右，11 000 bp片段應(yīng)該為質(zhì)粒開環(huán)的構(gòu)型，結(jié)果與預(yù)期一致，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.2漢灘病毒帶GFP標(biāo)簽假病毒制備通過上述的假病毒的制備方法，可以得到帶GFP綠色熒光的假病毒(圖2 A,B),圖A為漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株包膜糖蛋白的假病毒(VSVG-HTNV-GFP)，滴度約為3.5×105IU/mL圖B為VSV與自身G蛋白質(zhì)粒構(gòu)建的假病毒(VSVG-VSV-GFP).滴度約為2×107IU/mL. 可以從圖中看出VSVG-HTNV-GFP比VSVG-VSV-GFP的滴度低，原因可能為VSV自身G蛋白可以更有效率的與VSV骨架組裝，VSV包膜糖蛋白的構(gòu)象與漢灘病毒構(gòu)象不同可能也影響其滴度.

2.3假病毒對(duì)易感細(xì)胞Vero E6的感染性的觀察假病毒稀釋成不同的滴度感染Vero E6細(xì)胞時(shí)，在10-2稀釋倍數(shù)其對(duì)vero-E6的感染量最高，約1.92×107，隨后隨著稀釋倍數(shù)增加，感染量逐漸降低，因此選用10-2的稀釋倍數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3).

2.4漢坦病毒假病毒與HFRS患者血清的中和反應(yīng)研究本研究用帶Luciferase標(biāo)簽的假病毒與不同稀釋濃度的HFRS患者血清進(jìn)行中和反應(yīng)，其中患者血清已經(jīng)用ELISA方法證實(shí)有抗體(圖4)，在稀釋1∶50時(shí)血清幾乎可以中和所有的假病毒，隨著稀釋度增加，假病毒中和的量也隨之越來越少. 這說明漢灘病毒假病毒與活病毒一樣可以與HFRS患者血清進(jìn)行中和反應(yīng).

2.5漢灘病毒假病毒的抗原性研究將漢灘病毒活病毒，假病毒，分別與抗?jié)h灘型漢坦病毒 Gc的單克隆抗體(HCO2和11E10)，抗VSV單克隆抗體 mAb VSV，SNV，ANDV以及 HTNV 抗血清(來源于HPS/HFRS患者的血清)進(jìn)行反應(yīng)(圖5)A與B比較觀察可知，假病毒與活病毒對(duì)單克隆抗體和HFRS患者血清表現(xiàn)出相似的抗原性，另外從圖中可觀察到抗VSV單克隆抗體mAbVSV對(duì)漢灘病毒假病毒基本沒有中和作用，僅對(duì)VSVΔG-VSV 有抑制作用，這就表明假病毒中的VSV骨架蛋白對(duì)漢灘病毒表面蛋白所產(chǎn)生的中和作用沒有明顯影響.

2.6 漢灘病毒假病毒與活病毒受體研究有研究[10]表明β3整合素受體在致病性漢坦病毒進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用，但假病毒是否也可以利用β3整合素進(jìn)入細(xì)胞尚不明確，因此我們用抗β3整合素的 Reopro藥物預(yù)先處理細(xì)胞(圖6A)，ReoPro藥物對(duì)漢灘病毒進(jìn)入E6細(xì)胞的抑制率可達(dá)60%，對(duì)漢灘病毒假病毒的抑制率可達(dá)45%，說明ReoPro藥物可以同時(shí)減少致病性活漢灘病毒和假病毒進(jìn)入細(xì)胞，但是觀察發(fā)現(xiàn)ReoPro藥物對(duì)VSVΔG-GFP-VSV并沒有抑制作用，說明假病毒的骨架對(duì)其利用受體進(jìn)入細(xì)胞沒有影響. 另外我們用紫外UV滅活的HTNV 漢灘病毒預(yù)先與Vero-E6 細(xì)胞相互作用，處理組的假病毒進(jìn)入細(xì)胞的量明顯被抑制(圖6B). 這說明假病毒與其活病毒利用相同的受體進(jìn)入細(xì)胞.

2.7 漢灘病毒假病毒的包膜糖蛋白是以二聚體形式存在有研究[1]表明不同型別的包膜糖蛋白超微結(jié)構(gòu)略有不同，但均以GN,GC二聚體形式存在，而漢灘病毒假病毒表達(dá)的包膜糖蛋白是否也是二聚體形式尚不清楚，本研究用抗FLAG 的M2 抗體結(jié)合到 6 μm 珠子上，然后用去捕捉Gc，然后用Western Blot的方法進(jìn)行檢測(cè)，成熟的Gn和Gc分子量分別為68 kD和55 kD(圖7)，本研究用對(duì)沉淀洗脫后檢測(cè)，檢測(cè)到了Gn和Gc，表明漢灘病毒假病毒中Gn和Gc 是以二聚體形式存在.

3討論

近年來，HFRS的流行趨勢(shì)發(fā)生了變化，新的漢坦病毒的型別和亞型不斷出現(xiàn)，病毒的基因變異可能是其根本原因，而M片段編碼的GP蛋白承受來自宿主的免疫壓力最大，變異最為顯著，M基因編碼的GP蛋白在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，中和抗體形成，逃避機(jī)體免疫反應(yīng)等與致病相關(guān)的環(huán)節(jié)密切相關(guān)[1]. 漢坦病毒感染與其他有包膜病毒相同，均是由包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞膜上的受體特異性結(jié)合后啟動(dòng)的. 所以研究包膜糖蛋白與受體的識(shí)別結(jié)合機(jī)制，對(duì)于后續(xù)尋找特異性藥物和疫苗抑制漢坦病毒感染起始，從源頭阻斷其進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制有著很重要的意義. 本研究利用VSV為骨架構(gòu)建的假病毒系統(tǒng)帶有熒光標(biāo)簽，可以更為方便的進(jìn)行檢測(cè)，本研究中我們成功構(gòu)建了漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株的假病毒，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明假病毒對(duì)易感細(xì)胞VeroE6具有很高的感染性，并且能與單克隆抗體和HFRS血清發(fā)生中和反應(yīng)，假病毒中的GN和GC是以二聚體形式存在的,這是與活病毒的結(jié)構(gòu)一致，這是發(fā)揮生理活性的基礎(chǔ). 漢灘病毒與其假病毒不僅具有相同的抗原性，并且還利用相同

的受體進(jìn)入細(xì)胞，這為應(yīng)用假病毒來篩選抗?jié)h坦病毒藥物及疫苗效果評(píng)價(jià)，研究G蛋白在致病中的分子機(jī)制都提供了很好的工具.

【參考文獻(xiàn)】

[2] Ogino M, Ebihara H, Lee BH, et al. Use of vesicular stomatitis virus pseudotypes bearing hantaan or seoul virus envelope proteins in a rapid and safe neutralization test[J]. Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(1):154-160.

[3] Burns JC, Friedmann T, Driever W, et al. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(17): 8033-8037.

[4] Lawson ND, Stillman EA, Whitt MA, et al. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(10):4477-4481.

[5] Schnell MJ, Buonocore L, Kretzschmar E, et al. Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(21):11359-11365.

[6] Bácsi A, Ebbesen P, Szabo J, et al. Pseudotypes of vesicular stomatitis virus-bearing envelope antigens of certain HIV-1 strains permissively infect human syncytiotrophoblasts cultured in vitro:implications for in vivo infection of syncytiotrophoblasts by cell-free HIV-1[J]. J Med Virol,2001,64 (4):387-397.

[7] Maruyama J, Miyamoto H, Kajihara M, et al. Characterization of the envelope glycoprotein of a novel filovirus, lloviu virus[J]. J Virol,2014,88(1):99-109.

[8] Higa MM, Petersen J, Hooper J, et al. Efficient production of Hantaan and Puumala pseudovirions for viral tropism and neutralization studies[J]. Virology,2012,423(2):134-142.

[9] Ray N, Whidby J, Stewart S, et al. Study of Andes virus entry and neutralization using a pseudovirion system[J]. J Virol Methods,2010,163(2):416-423.

[10] Gavrilovskaya IN, Brown EJ, Ginsberg MH, et al. Cellular entry of hantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal syndrome is mediated by beta3 integrins[J]. J Virol,1999,73(5):3951-3959.

Construction and identification of hantaan pseudovirions

ZHONGYan,LIJin-Lin,CHENGLiang-Jun,YANGZhan-Qiu

Institute of Medical Virology/State Key Laboratory of Virology, School of Medicine of Wuhan University, Wuhan 430071, China

【Abstract】AIM: To study the molecular mechanism of hantaanvirus (HTNV) envelope glycoprotein with host cell, and constructe pseudovirions of HTNV 76-118 strains. METHODS: It was constructed by incorporating of HTNV glycoproteins onto replication-defective vesicular stomatitis virus(VSV) cores in which the gene for the surface G protein has been replaced by the reporter gene. Antigenicity, neutral reaction and receptor function were detected by neutralization test, co-immunoprecipitation and flow cytometry. RESULTS: There was good concordance of the antigenicity and the way inside host cells between HTNV and its pseudovirions. Also, the glycoprotein GNand GCof pseudovirions existed as heterodimers. CONCLUSION: The pseudovirions are successfully constructed and the pseudovirions can be used to simulate the way of HTNV entry and antigenicity. This study provides a good stool for study on molecular mechanism of hantaan virus envelope glycoprotein.

【Keywords】hantaan virus; pseudovirions; vesicular stomatitis virus(VSV); glycoprotein

文章編號(hào)：2095-6894(2016)04-01-05

收稿日期：2016-03-04；接受日期：2016-03-20

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371865)

作者簡(jiǎn)介：鐘研. 碩士. 研究方向:漢坦病毒感染與免疫. E-mail:zy20160217@163.com 通訊作者:楊占秋. 教授. 研究方向:病毒進(jìn)化與變異. E-mail:zqyang@whu.edu.cn

【中圖分類號(hào)】R373.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·