曹紅星，雷新濤，劉艷菊，孫程旭，張如蓮

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/ 海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 文昌 571339；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737）

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椰子抗寒相關(guān)生理生化指標(biāo)篩選及評(píng)價(jià)

曹紅星1，雷新濤1，劉艷菊1，孫程旭1，張如蓮2

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/ 海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 文昌 571339；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737）

摘 要：以2年生海南高種椰子、紅矮椰子和香水椰子3個(gè)椰子品種的幼苗為材料，根據(jù)溫度的日變化規(guī)律，設(shè)置不同的低溫度處理，分別為CK（自然溫度處理）、16℃（T1處理）、12℃（T2處理）、8℃（T3處理），利用相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析法研究了低溫脅迫下椰子葉片MDA含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化，對(duì)抗寒密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)進(jìn)行篩選，對(duì)不同椰子品種的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：根據(jù)不同品種抗寒性相關(guān)生理生化指標(biāo)變化幅度的不同，抗寒性強(qiáng)弱依次為海南高種椰子＞紅矮椰子＞香水椰子。脯氨酸含量和POD活性與其他指標(biāo)相關(guān)性高，不同低溫處理間差異較大，可以聚為不同類分別代表滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶類的指標(biāo)，主成分分析結(jié)果表明，這2個(gè)指標(biāo)可反映其他指標(biāo)信息，可作為椰子抗寒鑒定指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫；椰子；生理生化指標(biāo)

椰子（Cocos nucifera L.）屬棕櫚科典型的熱帶喜溫作物［1］，最適生長(zhǎng)溫度為26～27℃。一年中若有1個(gè)月的平均溫度為18℃，其產(chǎn)量則明顯下降，若平均溫度低于15℃，就會(huì)引起落花、落果和葉片變黃。因此，低溫對(duì)椰子的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量有較大影響。如果抗寒育種取得突破性進(jìn)展，將對(duì)提高椰子在低溫季節(jié)的產(chǎn)量、擴(kuò)大椰子的種植面積、推動(dòng)椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到重要作用，但抗寒品種在生產(chǎn)和育種中的應(yīng)用還應(yīng)建立在對(duì)其抗寒性的鑒定和抗寒生理的認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上［2］。

低溫對(duì)椰子生長(zhǎng)和產(chǎn)量影響的研究較少，目前僅有寒害之后的落裂果數(shù)及植株、葉片受害表現(xiàn)等的調(diào)查研究，認(rèn)為不同椰子品種對(duì)冬季低溫耐受力不同，落裂果程度有所不同，在所調(diào)查品種中，落裂果最嚴(yán)重的是黃矮，海南高種椰子落裂果最少；本地椰子品種耐寒性較好，香水椰子的耐寒性較差［3-5］。有研究采用電導(dǎo)法分析了5個(gè)椰子品種在低溫脅迫后細(xì)胞原初部位原生質(zhì)膜受低溫處理后滲透性發(fā)生變化，配合Logistic方程，確定不同椰子品種的半致死溫度在7.34～12.44℃之間，容易受寒害影響［6］。但有關(guān)對(duì)椰子抗寒相關(guān)生理生化指標(biāo)篩選的研究還未見報(bào)道。因此，本研究通過分析3個(gè)椰子品種（海南高種椰子、紅矮椰子和香水椰子）在不同低溫脅迫處理下生理生化指標(biāo)的變化，篩選出與抗寒相關(guān)的生理生化指標(biāo)，為抗寒種質(zhì)資源的早期篩選鑒定和抗寒品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試3個(gè)椰子品種（海南高種椰子、紅矮椰子和香水椰子）取自海南省文昌市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所育苗基地，選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、無病害的2年生盆栽苗。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年2月開始進(jìn)行，選取生長(zhǎng)一致的盆栽苗在植物光照培養(yǎng)箱（型號(hào)RXZ-280B）中進(jìn)行低溫脅迫，以正常自然條件下盆栽處理為對(duì)照（CK），根據(jù)自然條件下溫度的日變化進(jìn)行模擬，設(shè)置16℃（T1）、12℃（T2）、8℃（T3）3個(gè)低溫處理（表1）。放入光照培養(yǎng)箱中處理21 d后，以頂端下第2～3片葉定為樣品葉進(jìn)行取樣，每個(gè)處理3株。葉片相對(duì)電導(dǎo)率（REC）采用DDS-307型電導(dǎo)率儀［7］測(cè)定，相對(duì)含水量采用飽和吸水的方法［8］測(cè)定，葉綠素含量采用分光光度法［8］測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法［8］測(cè)定，可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯法［8］測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［8］測(cè)定，游離脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮比色法［8］測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性采用張治安等［9］的方法測(cè)定。每個(gè)生理生化指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

利用Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后采用SPSS軟件和DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、Duncan多重比較分析、相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析。

表1 不同處理的溫度日變化

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)椰子幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化的影響

由表2可知，海南高種椰子、紅矮椰子和香水椰子葉片的MDA、可溶性糖含量都隨著處理溫度的降低呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，變化幅度依次為香水椰子＞紅矮椰子＞海南高種椰子，對(duì)照和各處理間都達(dá)到差異顯著的水平。

3種椰子的葉片可溶性蛋白、脯氨酸含量在不同低溫處理下也呈上升的變化趨勢(shì)，其中海南本地高種變化幅度最大，香水椰子最小，可能與不同品種的抗寒能力有關(guān)。尤其可溶性糖含量在不同處理間的差異都達(dá)到顯著或極顯著水平，該指標(biāo)對(duì)低溫處理反應(yīng)較快，變化明顯，與抗寒性的關(guān)系較為密切。

表2 低溫脅迫對(duì)3個(gè)品種椰子幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化的影響

2.2 低溫脅迫對(duì)椰子幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響

從表3可以看出，3種椰子的SOD、POD、CAT、APX活性變化都隨著處理溫度的降低呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，尤其POD活性在不同低溫處理下變化較為明顯，對(duì)照和各處理間的差異都達(dá)到極顯著水平，該指標(biāo)可能對(duì)低溫的反應(yīng)較為敏感，可在抗寒鑒定時(shí)加以利用。

表3 低溫脅迫對(duì)3個(gè)品種椰子幼苗葉片保護(hù)酶活性活性的影響

2.3 不同低溫脅迫下3種椰子生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析

由表4可知，可溶性糖含量與MDA含量呈極顯著正相關(guān)；可溶性蛋白含量分別與脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性和APX活性呈極顯著正相關(guān)；脯氨酸含量分別與SOD活性、POD活性、CAT活性和APX活性呈極顯著正相關(guān)；SOD活性分別與POD活性、CAT性呈極顯著正相關(guān)，與APX活性呈顯著正相關(guān)；POD活性分別與CAT活性和APX活性呈極顯著和顯著正相關(guān)。由此可知，可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、CAT活性、APX活性、SOD活性和POD活性與其他指標(biāo)間的相關(guān)性較高。

2.4 不同低溫脅迫下椰子生理生化指標(biāo)聚類分析

根據(jù)聚類分析結(jié)果（圖1）可知，MDA含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性、脯氨酸含量和CAT活性先聚為一類，即為相似水平類；再與APX活性進(jìn)行聚類，最后再與POD活性進(jìn)行聚類。其中APX活性和POD活性都是單獨(dú)為一類，無相似項(xiàng)。同為一類的指標(biāo)可以進(jìn)行簡(jiǎn)化，用一個(gè)因素代表其他因素。在第一類群中，可溶性蛋白含量和脯氨酸含量與其他指標(biāo)間的相關(guān)性均較高，但在方差分析中脯氨酸含量在不同處理下差異較大，不同處理間差異均達(dá)顯著或極顯著水平，因此脯氨酸含量可以作為低溫處理下滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)的代表。APX活性和POD活性雖然都單獨(dú)聚為一類，在相關(guān)性分析時(shí)，APX活性和POD活性與其他指標(biāo)間的相關(guān)性都較高，但在方差分析中，POD活性在不同處理間都達(dá)到顯著差異水平，可以選擇POD活性為保護(hù)酶活性的代表指標(biāo)。

表4 3個(gè)椰子品種抗寒生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析

圖1 椰子抗寒相關(guān)生理生化指標(biāo)聚類結(jié)果

綜合相關(guān)性分析、方差分析和聚類分析的結(jié)果，椰子抗寒鑒定指標(biāo)可以簡(jiǎn)化為脯氨酸含量和POD活性兩個(gè)主要指標(biāo)，其中脯氨酸含量為滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)，POD活性為保護(hù)酶活性的代表指標(biāo)。

2.5 不同低溫脅迫下椰子生理生化指標(biāo)主成分分析

由表5可知，選取特征值λ＞1的前2個(gè)主成分，提供的信息量分別為62.190%和28.538%，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到90.728%，說明前2個(gè)主成分能代表原來生理生化指標(biāo)的大部分（90.728%）信息，表明主成分分析能較好地將原始信息約化在主分量中。

表5 方差分解主成分提取分析結(jié)果

由表6可知，可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性和APX活性在主成分1上有較高載荷，說明主成分1基本反映了這些指標(biāo)的信息；MDA含量和可溶性糖含量在主成分2上有較高載荷，說明主成分2基本反映了MDA含量和可溶性糖含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)的信息?？梢?，提取這2個(gè)主成分可以基本反映全部指標(biāo)的信息，因此決定用2個(gè)新變量來代替原來的8個(gè)變量。

表6 初始因子載荷矩陣

3 結(jié)論與討論

對(duì)作物進(jìn)行抗寒性鑒定的方法較多，如聚類分析方法、隸屬函數(shù)法、模糊評(píng)判法和主成分分析法等［10-13］。其中聚類分析不需要人為設(shè)定權(quán)值，保證了結(jié)果數(shù)據(jù)的客觀統(tǒng)一，而用主成分分析法把性狀指標(biāo)進(jìn)行降維壓縮，將分散在一組變量上的信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)。運(yùn)用主成分分析法和系統(tǒng)聚類方法對(duì)抗寒密切相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，簡(jiǎn)化后的抗寒評(píng)價(jià)指標(biāo)可以反映指標(biāo)的絕大部分信息，使篩選的抗寒指標(biāo)更具有代表性和全面性，為科學(xué)評(píng)價(jià)作物的抗寒性提供理論依據(jù)［14］。相關(guān)研究表明，在低溫脅迫下，大葉女貞葉片丙MDA含量和可溶性糖含量出現(xiàn)“上升趨勢(shì)越早、上升幅度越大，其抗寒性越差”［15］的現(xiàn)象；抗寒性強(qiáng)的葡萄品種可溶性全蛋白隨著溫度下降增加的幅度大；抗寒性差的品種下降增加的幅度?。?6］。本研究結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，3個(gè)椰子品種的MDA含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，MDA含量和可溶性糖含量變化幅度表現(xiàn)為香水椰子＞紅矮椰子＞海南高種椰子，可溶性蛋白含量和脯氨酸含量的變化幅度表現(xiàn)為海南高種椰子＞紅矮椰子＞香水椰子，3種椰子的抗寒性表現(xiàn)為海南高種椰子＞紅矮椰子＞香水椰子，這與本課題組之前的研究結(jié)果［6］相似。3種椰子的SOD、POD、CAT和APX活性隨著處理溫度的降低，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明其可通過提高酶活性來增強(qiáng)對(duì)低溫的適應(yīng)性，但椰子對(duì)低溫較為敏感，隨后活性下降，甜櫻桃、茶樹、楊樹和石榴等植物上也有類似試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果［17-19］。

對(duì)不同抗寒生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析的結(jié)果表明，可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、CAT活性、APX活性、SOD活性和POD活性與其他指標(biāo)間的相關(guān)性較高。對(duì)上述數(shù)據(jù)采用聚類分析法，同一相似類別可選用一個(gè)指標(biāo)因子代表其他指標(biāo)因子，與方差分析、相關(guān)性分析和主成分分析研究的結(jié)果相結(jié)合，椰子抗寒鑒定指標(biāo)可以簡(jiǎn)化為脯氨酸含量和POD活性兩個(gè)指標(biāo)，且可以反映出絕大部分信息。

通過對(duì)椰子抗寒相關(guān)生理生化指標(biāo)篩選及其評(píng)價(jià)的研究發(fā)現(xiàn)，海南高種椰子的抗寒性較強(qiáng)，香水椰子的抗寒性較差，脯氨酸含量和POD活性兩個(gè)指標(biāo)與椰子的抗寒性密切相關(guān)，可在椰子抗寒鑒定評(píng)價(jià)時(shí)加以利用。

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（責(zé)任編輯 張輝玲）

Identification and comprehensive evaluation of cold resistance indexes of coconut

CAO Hong-xing1，LEI Xin-tao1，LIU Yan-ju1，SUN Cheng-xu1，ZHANG Ru-lian2
（1. Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops，Wenchang 571339，China；2. Tropical Crops Genetic Resources Research Institute，Chines Acadeiny of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737，China）

Abstract：Taking two years old Hainan tall coconut，red dwarf coconut and aromatic coconut seedlings as materials，four low temperature treatments，including CK （natural temperature treatment），16℃ （T1 treatment），12℃ （T2 treatment），8℃ （T3 treatment） were designed according to the daily temperature change regularity. After treated for 21 days，the changes of malondialdehyde （MDA）content，soluble sugar content，soluble protein content，free proline content，superoxide dismutase （SOD） activity，peroxidase （POD） activity，catalase （CAT） activity，ascorbate peroxidase （APX） activity were analyzed. The data were treated by pertinence analysis，clustering analysis，principal component analysis for cold resistance indexes identification and their comprehensive evaluation of cold tolerance. The results showed that there were different change tendency of physiological and biochemical traits under low temperature treatments in different coconut varieties，the cold resistance of the three varieties were listed as Hainan tall coconut ＞ red dwarf coconut ＞ aromatic coconut. Free proline content and POD activity were highly related with other indexes，there were greater differences under different low temperature treatments，they were clustered into different classes and indicated as osmotic substance and protective enzyme index，respectively. These two indexes could reflect the information of other indexes according to the principal component analysis. Free proline content and POD activity could be identified as cold resistance evaluation indexes of coconut.

Key words：low temperature stress；coconut；physiological and biochemical index

中圖分類號(hào)：S59

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）02-0049-06

收稿日期：2015-07-14

基金項(xiàng)目：中央級(jí)事業(yè)單位基本業(yè)務(wù)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（1630032015012）；海南省自然科學(xué)基金（314148）

作者簡(jiǎn)介：曹紅星（1977-），女，博士，副研究員，E-mail：hongxing1976@163.com