楊 娟，陳蘭珍*，薛曉鋒，吳黎明，李 熠，趙 靜, 吳招斌，張妍楠

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100093 3. 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)，北京 100081 4. 國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心, 北京 102202

近紅外光譜技術(shù)快速鑒別蜂膠品種的可行性研究

楊 娟1, 2，陳蘭珍1, 2*，薛曉鋒1, 2，吳黎明1, 2，李 熠1, 2，趙 靜3, 吳招斌1, 2，張妍楠2

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100093 3. 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京)，北京 100081 4. 國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心, 北京 102202

不同植物源的蜂膠物質(zhì)組成不同，其生理和藥理活性也存在著一定的差異。目前主要是根據(jù)蜂膠中物質(zhì)組成及其含量的不同來鑒別蜂膠植物源，存在著一些局限性。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確鑒別蜂膠植物源的方法具有重要的意義。以三種不同植物源的蜂膠(楊樹型蜂膠、樺樹型蜂膠和橡樹型蜂膠)為研究對象，利用傅里葉變換近紅外光譜儀對蜂膠的無水乙醇溶液進(jìn)行光譜掃描，采用主成分分析結(jié)合馬氏距離判別法和典型判別分析分別建立蜂膠品種的判別模型并對其性能進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明： 在經(jīng)過光譜預(yù)處理和主成分分析后，得到最佳的光譜建模波段為4 500～12 000 cm-1,最佳的光譜預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay(7)平滑； 主成分分析結(jié)合馬氏距離判別法建立的判別模型校正集和檢驗(yàn)集的判別準(zhǔn)確率分別為93.62%和82.61%； 典型判別分析建立的判別模型的判別準(zhǔn)確率為91.4%，交叉檢驗(yàn)的判別準(zhǔn)確率為88.6%。由此可知，主成分分析結(jié)合馬氏距離判別法與典型判別分析對蜂膠樣品的分類效果均較好。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法應(yīng)用于蜂膠植物源的快速、準(zhǔn)確鑒別具有一定的可行性和實(shí)用性。

近紅外光譜技術(shù)； 蜂膠； 植物源鑒別； 主成分分析結(jié)合馬氏距離判別法； 典型判別分析

引 言

蜂膠是蜜蜂從植物的莖、腋芽處采集的樹脂，并混入自身上顎腺的分泌物、花粉和蜂蠟等物質(zhì)，最終得到的一種具有特殊氣味的黏性混合物[1]。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，并具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化[2-3]、抗微生物[4]、免疫增強(qiáng)[5-6]、抗腫瘤、降血糖、降血脂[7-8]等。蜂膠作為一種獨(dú)特而寶貴的純天然保健食品資源和藥源受到越來越廣泛的關(guān)注。我國地域廣闊，氣候類型多變，不同氣候條件下生長的產(chǎn)膠植物不同導(dǎo)致蜂膠的植物來源也不一樣[9]。目前，普遍認(rèn)為中國蜂膠的植物源主要是楊樹、松樹、柳樹、樺樹及桉樹等[10]。研究表明，不同植物源的蜂膠無論是在營養(yǎng)組分還是生理、藥理功能上都存在巨大差異[11]。對于蜂膠品種的鑒別技術(shù)，國內(nèi)外的專家學(xué)者也進(jìn)行了一些研究。早在1993年Tomás-Barberán等使用高效液相色譜法(HPLC)建立了37個(gè)蜂膠樣品中黃酮類化合物的指紋圖譜，根據(jù)蜂膠中所含黃酮類物質(zhì)的差異，可對以楊樹科和藤黃科作為植物源的蜂膠進(jìn)行區(qū)分[12]。2013年Falc?o等[13]采用HPLC和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)相結(jié)合，測定蜂膠中黃酮類的成分，發(fā)現(xiàn)山奈苷可以作為區(qū)別楊樹蜂膠和巖薔薇蜂膠的特征性物質(zhì)。2014年Isidorov等[14]使用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測定了蜂膠提取液中黃酮類物質(zhì)的成分，不僅可以有效地鑒定出植物源為白樺樹和黃樺樹的蜂膠樣品，還可以檢測出蜂膠樣品中混合的膠源植物成分。

目前，蜂膠品種的鑒別技術(shù)主要使用的是HPLC，GC-MS，LC-MS/MS等，以上方法樣品前處理比較繁瑣，檢測耗時(shí)，儀器操作復(fù)雜，不適用于大批量樣品的快速鑒別。近紅外光譜技術(shù)以其簡便、快速、無損、高效等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、石油工業(yè)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域[15-17]，但是在蜂膠品種的鑒別方面報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立蜂膠品種的判別模型。并對模型進(jìn)行優(yōu)化探討，同時(shí)對模型的鑒別和預(yù)測效果進(jìn)行了檢驗(yàn)，為蜂膠植物源鑒別提供了方法和理論上的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用蜂膠于2012年—2013年采自我國3個(gè)省份共70個(gè)樣品，其中包括楊樹膠28個(gè)(河南省、遼寧省)，橡樹膠23個(gè)(云南西雙版納)，樺樹膠19個(gè)(吉林省吉林市)。所選取的蜂場方圓5 km以內(nèi)膠源植物相對單一，保證實(shí)驗(yàn)材料的真實(shí)性。

1.2 儀器與樣品制備和光譜采集

MPA傅里葉變換近紅外光譜儀(配備InGaAS檢測器、液體光纖探頭2 mm、OPUS 6.5)德國Bruker； 分析軟件采用MATLAB R2009b，TQ Analyst V6.0 和SPSS 21.0。

稱取0.1～0.3 g蜂膠樣品，加入5～10 mL無水乙醇溶解，離心后取上清液過濾以用于近紅外光譜數(shù)據(jù)采集。

近紅外光譜儀檢測參數(shù)設(shè)置為： 掃描范圍4 500～12 000 cm-1、分辨率4 cm-1、掃描次數(shù)64次、采集模式為透反射。每個(gè)樣品平行掃描3次，取平均值作為該樣品的原始光譜。光譜采集過程中，以無水乙醇作為背景，扣除乙醇分子的振動吸收峰，使蜂膠中所含成分信息顯現(xiàn)。

1.3 模型的建立

首先建立不同光譜預(yù)處理方法和不同光譜波段下蜂膠品種的鑒別模型，優(yōu)化出最佳預(yù)處理方法和光譜建模波段； 計(jì)算光譜數(shù)據(jù)的主成分得分，最后使用光譜矩陣的得分向量進(jìn)行馬氏距離判別和典型判別分析，建立蜂膠樣品的類模型； 最后對模型的分類效果進(jìn)行檢驗(yàn)。主成分分析法可以將蜂膠近紅外光譜中可能重疊的物質(zhì)信息提取出來并組成綜合成分，避免建模過程中選擇過多波長造成的過度擬合，減少數(shù)據(jù)量提高模型的準(zhǔn)確度和運(yùn)算速度。馬氏距離判別法是對已知分類樣品數(shù)據(jù)的識別學(xué)習(xí)，建立相應(yīng)的識別規(guī)則，進(jìn)而對未知樣本進(jìn)行判別； 典型判別分析首先將所有的樣品進(jìn)行分類建模，然后對模型進(jìn)行交叉檢驗(yàn)，計(jì)算模型的判別準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜預(yù)處理和主成分分析

圖1所示為三種蜂膠樣品的原始近紅外光譜圖，橫坐標(biāo)為波長范圍，縱坐標(biāo)為吸光度值。由圖可知，不同的蜂膠樣品主要化學(xué)物質(zhì)在紅外譜圖中吸收峰的位置極為相似，但是其吸光度值有一定差異。5 800～6 200 cm-1附近是黃酮類苯環(huán)上C—H伸縮振動的一級倍頻吸收； 4 650 cm-1附近是N—H振動合頻的吸收帶； 6 000 cm-1附近波段主要為C—H和H—O一級倍頻與合頻吸收； 5 200和7 000 cm-1是H—O的合頻和二倍頻的吸收帶。

在建立蜂膠近紅外光譜定性模型過程中，需要對建模波段進(jìn)行選擇，同時(shí)要選擇一定的光譜預(yù)處理方法。光譜預(yù)處理可以將原始光譜中難以識別的信號進(jìn)行變換函數(shù)處理，挖掘或歸納出原始光譜中隱含的特征性、細(xì)微性信息，降低那些信息量小、失真大的譜區(qū)對模型真實(shí)性和穩(wěn)定性的影響。為使模型達(dá)到最佳的建模效果，本研究采用的是一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay(7)平滑對光譜進(jìn)行預(yù)處理，光譜波段選擇為4 500～12 000 cm-1。之后使用MATLAB軟件計(jì)算蜂膠光譜的主成分得分，選取合適的因子個(gè)數(shù)，為接下來模型的建立提供有效的數(shù)據(jù)參考。

圖1 蜂膠樣品的近紅外光譜圖

表1 前十個(gè)主成份累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

Table 1 Ten principal components and accumulative reliabilities

主成分/%方差貢獻(xiàn)率/%累計(jì)貢獻(xiàn)率/%PC175.34575.345PC211.05186.396PC36.01792.413PC44.49696.909PC52.83599.744PC60.16999.913PC70.04999.962PC80.01899.980PC90.00499.984PC100.00299.986

首先利用近紅外光譜儀自帶的OPUS 6.5 軟件將每個(gè)樣品的近紅外光譜轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)點(diǎn)，光譜波段從4 500～12 000 cm-1共有3 919個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，但是采用3 919數(shù)據(jù)點(diǎn)建模時(shí)，計(jì)算量大，而且光譜信息較弱的數(shù)據(jù)點(diǎn)會對判別模型的準(zhǔn)確性和可靠性產(chǎn)生一定的影響，所以有必要對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。主成分分析的結(jié)果如表2所示，隨著因子數(shù)的增加主成分的累積方差貢獻(xiàn)率也不斷的增大，前10個(gè)主成分(principle component，PC)的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.986%，趨近100%，基本涵蓋樣品的信息。

2.2 主成分分析馬氏距離判別模型

將70個(gè)蜂膠樣品按照2∶1的比例隨機(jī)分為校正集和檢驗(yàn)集，校正集47個(gè)，檢驗(yàn)集23個(gè)。采用前十個(gè)主成分因子結(jié)合馬氏距離判別法建立蜂膠品種的判別模型，結(jié)果如表3所示。校正集與檢驗(yàn)集的總體判別率分別為93.62%和82.61%，校正集中每個(gè)品種的蜂膠樣品的判別準(zhǔn)確率均在80%以上，表明所建立的判別模型具有較高的可靠性。檢驗(yàn)集中橡樹膠和樺樹膠的判別準(zhǔn)確率為100%，楊樹膠的誤判的概率較大，準(zhǔn)確率為63.64%。

表2 主成分-馬氏距離分析判別結(jié)果

圖2為三種蜂膠樣品的主成分分析馬氏距離判別分析圖，三種蜂膠樣品大致落在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)，表現(xiàn)出較好的區(qū)分效果。楊樹膠的樣品分布介于橡樹膠與樺樹膠之間，樣品的成分信息有一定部分的重疊； 由于有一部分楊樹膠的樣品采自遼寧，而且蜂蜜在采集的過程中不可能絕對的收集到單一品種的樹膠，楊樹膠中可能會混入一些其他的樹膠成分，導(dǎo)致蜂膠品種間的差異減小，產(chǎn)生錯判，降低了模型的型的判別準(zhǔn)確率。

圖2 主成分-馬氏距離判別散點(diǎn)圖

圖3 典型判別分析散點(diǎn)圖

2.3 典型判別分析

用前兩個(gè)典型判別函數(shù)對各個(gè)樣品做散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖3所示。3個(gè)不同品種的蜂膠樣品都圍繞在組質(zhì)心，且三個(gè)蜂膠品種的組質(zhì)心能夠較好的分開，沒有相互重疊。從該圖還可以直觀看出，不同品種的蜂膠樣品隨品種集中的趨勢非常明顯。

使用采用前十個(gè)主成分因子結(jié)合典型判別分析建立蜂膠品種的判別模型，并對模型進(jìn)行交互檢驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，模型對樺樹膠、橡樹膠和楊樹膠的判別準(zhǔn)確率分別為84.2%, 95.7%和92.9%，整體的判別準(zhǔn)確率為91.4%，對模型進(jìn)行交互檢驗(yàn)的整體判別準(zhǔn)確率為88.6%。

表3 典型判別分析結(jié)果

3 結(jié) 論

選取3個(gè)不同品種的蜂膠(楊樹型蜂膠、樺樹型蜂膠和橡樹型蜂膠)為研究對象，結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)+S-G(7)平滑對光譜進(jìn)行預(yù)處理，利用主成分分析結(jié)合馬氏距離判別法和典型判別分析建立蜂膠品種的判別模型。馬氏距離判別法建立的判別模型校正集與檢驗(yàn)集準(zhǔn)確率分別是93.62%和82.61%； 典型判別分析的判別準(zhǔn)確率為91.4%，交叉檢驗(yàn)的判別準(zhǔn)確率為88.6%。結(jié)果表明，近紅外光譜應(yīng)用于蜂膠品種鑒別是可行的，而且檢測效率和準(zhǔn)確率較高，在蜂膠品種快速鑒別方面具有很大的應(yīng)用前景。

使用近紅外光譜技術(shù)鑒別蜂膠品種國內(nèi)外的研究較少，處于初步的摸索階段。為了提高模型的穩(wěn)定性、適用性和廣泛性，在后續(xù)的研究中會繼續(xù)增加蜂膠樣品的品種和數(shù)量，不斷對模型進(jìn)行修正和優(yōu)化，建立統(tǒng)一化的模型標(biāo)準(zhǔn)，為我國蜂膠品種的快速鑒別提供一種高效低成本快速的新方法。

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*Corresponding author

(Received Jan. 26, 2015; accepted May 6, 2015)

A Feasibility Study on the Discrimination of the Propolis Varieties Based on Near Infrared Spectroscopy

YANG Juan1, 2, CHEN Lan-zhen1, 2*, XUE Xiao-feng1, 2, WU Li-ming1, 2, LI Yi1, 2, ZHAO Jing3, WU Zhao-bin1, 2,ZHANG Yan-nan2

1. Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China 2. Risk Assessment Laboratory for Bee Products Quality and Safety of Ministry of Agriculture (Beijing), Beijing 100093, China 3. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing), Beijing 100081, China 4. Apicultural Branch Center, Research and Development Center of National Agro-Food Processing Technology, Beijing 102202, China

Botanical origins of propolis are significant factors affecting biological and pharmacological activities because of different components in propolis. Until now, the determination of propolis botanical origins is mainly based on different varieties and the content of the compositions with great limitations. Therefore, it is important to discriminate different botanical origins of propolis quickly and accurately. In this study, Near-infrared (NIR) spectra of propolis varieties based on principal component analysis mahalanobis distance (PCA-mahalanobis distance) model and canonical discriminant analysis model were built for the classification of three botanical origins (poplar propolis，brich propolis and rubber propolis). The models were built based on the optimal pretreatment method and bands of first derivative + Savitzky-Golay (7) filter and 4500～12 000-1, which were selected in advance. After the principal component analysis, the correct classification rates of calibration sets and validation sets in analysis mahalanobis distance models were 93.62% and 82.61%, respectively. The discrimination rate and the cross-validation rate of canonical discrimination models were 91.4% and 88.6%, respectively. Therefore, NIR spectroscopy with chemometric methods is not only feasible but also practical for rapid and accurate identification of varieties of propolis.

Near infrared spectroscopy; Propolis; Botanical origins discrimination; PCA-mahlanobis distance; Canonical discriminate analysis

2015-01-26，

2015-05-06

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(S201203046)，國際原子能機(jī)構(gòu)項(xiàng)目(IAEA)合作項(xiàng)目(16567-RO)，2015年國家特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估項(xiàng)目(GJFP2015010)資助

楊 娟，女，1991年生，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所碩士研究生 e-mail: 15600581748@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： chenlanzhen2005@126.com

TS207.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1717-04