任會(huì)丹，張琳?，趙穎，司新紅，張亮，王澈 ,2Δ

(1.遼寧師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，遼寧 大連 116029；2.遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽抑制血管新生和黑色素瘤轉(zhuǎn)移侵襲的作用研究

任會(huì)丹1，張琳1?，趙穎1，司新紅1，張亮1，王澈1,2Δ

(1.遼寧師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，遼寧 大連 116029；2.遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 篩選抗菌肽Temporin-1CEa及其6種改造肽對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的抑制作用，并考察其在體外對(duì)A375細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲和血管新生的影響。方法 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移/侵襲能力；體外基質(zhì)膠小管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管生成，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞MMP-2和VEGF的釋放量。結(jié)果 Temporin-1CEa及其改造肽LK1，LK2(6)A(L)，對(duì)A375細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制活性，而對(duì)人永生化表皮細(xì)胞HaCat的細(xì)胞毒作用較弱；同時(shí)，這3種肽對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖亦具有較強(qiáng)的抑制作用，提示其可能具有血管新生抑制活性。HUVEC細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和體外基質(zhì)膠小管實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)這3種肽確實(shí)能夠有效的抑制HUVEC細(xì)胞的遷移，并對(duì)血管新生產(chǎn)生濃度依賴性的抑制作用。A375細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3種肽還能夠顯著地抑制A375細(xì)胞的遷移和侵襲。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3種肽的上述作用可能與其顯著降低A375細(xì)胞的MMP-2和VEGF釋放量有關(guān)。結(jié)論 Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)不僅對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性細(xì)胞毒作用，并抑制其遷移和侵襲，還具有較好的血管新生抑制活性，有望成為新型的抗黑色素瘤治療藥物。

抗菌肽；黑色素瘤；血管新生；轉(zhuǎn)移；侵襲

腫瘤的惡性增殖靠營(yíng)養(yǎng)和氧來維持，腫瘤周圍的新生血管可以提供這2種必需物，而新生血管的形成還會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[1]。有研究證明，人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平與血管密度、腫瘤的生長(zhǎng)速率和轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)[2]。其中，VEGF作為一種有效的促血管生成因子，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化[3]。而MMPs則在腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲過程中發(fā)揮重要的作用。黑色素瘤是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，死亡率高[4]，外科手術(shù)預(yù)后差，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]，所以開發(fā)新型抗黑色素瘤藥物并且研究通過抑制血管新生干預(yù)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移侵襲具有一定的理論和實(shí)際價(jià)值。

陽離子抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是天然免疫系統(tǒng)的一種小分子多肽，其分子量較小，具有明顯的兩親性，帶正電荷，使其對(duì)細(xì)胞膜帶負(fù)電荷物質(zhì)較多的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的選擇性，而對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較小。本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的Temporin-1CEa是從中國(guó)林蛙皮膚分泌物中提取的的天然陽離子抗菌肽，由17個(gè)氨基酸殘基組成，帶3個(gè)凈正電荷，具有典型的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的抑制活性[6]；此外，本研究還以Temporin-1CEa為模板，通過改變其電荷和疏水性設(shè)計(jì)出6種改造肽LK1、LK2(6)、LK2(5)、LK3、LK2(6)A(L)、LK2(6)AN(2L)。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Temporin-1CEa對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞膜表面所帶負(fù)電荷物質(zhì)則是此類陽離子抗菌肽選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要原因之一[7]。本論文將對(duì)Temporin-1CEa及其改造肽抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行篩選，并考察其對(duì)血管新生以及A375細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人黑色素瘤A375細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；人永生化表皮HaCat細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：Temporin-1CEa及其改造肽(上海吉爾生化有限公司)；MTT(Sigma公司)；人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)酶聯(lián)免疫試劑盒和人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海春曉生物技術(shù)有限公司)；其他分析純?cè)噭?哈爾濱化工化學(xué)試劑廠)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：IX71倒置熒光顯微鏡(Olympus)；Multiskan Ascent?microplate reader酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；Transwell小室Transwell insert(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375和HaCat細(xì)胞，配成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，每孔100 μL接到96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)有對(duì)照組與加肽組：對(duì)照組只有細(xì)胞液不外加任何物質(zhì)；加肽組加入抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽，終濃度為5、10、20、40、60、80和100 μM，作用1 h，加入MTT培養(yǎng)4 h后，棄上清再加入DMSO，在492 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，重復(fù)3次。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

篩選出對(duì)A375細(xì)胞有選擇性的抗菌肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，用上述方法測(cè)篩選后的抗菌肽對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞, 以1×105個(gè)/mL(2 mL/孔)密度接種到6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育48 h后，將原培養(yǎng)液吸去，用200 μL移液器吸頭在單層細(xì)胞上呈“一”字型劃痕，用PBS洗2～3次，加入無血清培養(yǎng)液，饑餓處理4 h，吸去培養(yǎng)液，加入含5%FBS培養(yǎng)液，再加入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組肽的濃度為0 μM，實(shí)驗(yàn)組使肽的終濃度為2.5、5、10、20、25 μM處理1 h后，在倒置熒光顯微鏡20倍下觀察并拍照。

1.2.3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：Transwell小室放置在24孔板，取500 μL培養(yǎng)液，將HUVEC細(xì)胞和A375細(xì)胞接種在上室，并向A375細(xì)胞Transwell下室加入VEGF，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和加肽組，對(duì)照組肽的濃度為0 μM，實(shí)驗(yàn)組分別向2組細(xì)胞Transwell上室加入2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1及LK2(6)A(L)。16 h過后除去小室上表面的細(xì)胞，下側(cè)固定于10%福爾馬林緩沖液1 h，PBS洗滌3～5次后用HE(蘇木精—伊紅)染色。脫色，干燥后，使用倒置熒光顯微鏡20倍下觀察并照相。按照公式計(jì)算細(xì)胞遷移抑制率：

1.2.4 體外血管生成檢測(cè)：基底膠溶液以每孔150 μL涂于24孔板中，排除基質(zhì)膠中的氣泡，冰上放置20 min后，放置37 ℃孵育30 min。HUVEC細(xì)胞以4×104個(gè)/mL密度接種在基質(zhì)膠上面，每孔1 mL。經(jīng)過12 h，37 ℃孵育，加入濃度為2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組肽的濃度為0 μM，作用1 h，使用倒置熒光顯微鏡20倍下采集圖像， 計(jì)數(shù)形成管腔個(gè)數(shù)。

1.2.5 ELISA方法檢測(cè)A375細(xì)胞釋放MMP-2和VEGF含量： 培養(yǎng)A375細(xì)胞，將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接板，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2過夜培養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組只有細(xì)胞液不外加任何物質(zhì)；加肽組加入終濃度為1.25、2.5、10和15 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)，作用30 h后收集不同濃度的肽作用細(xì)胞的上清液，3000 r/min，20 min。按人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)酶聯(lián)免疫試劑盒和人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書檢測(cè)MMP-2和VEGF含量。

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測(cè)Temporin-1CEa及其改造肽對(duì)A375、HaCat和HUVEC細(xì)胞的增殖抑制作用 由表1中可以看出LK2(5)作用于A375和HaCat的IC50超過100，說明這2種肽對(duì)細(xì)胞的抑制作用很不顯著，篩選出IC50在30 μM以下的肽，分別為Temporin-1CEa、LK1、LK2(6)A(L)和LK2(6)AN(2L)，這4種肽對(duì)A375細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，但LK2(6)AN(2L)對(duì)HaCat IC50( μM)值大于A375細(xì)胞的，這說明LK2(6)AN(2L)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較癌細(xì)胞強(qiáng)，所以最后篩選出Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)3種肽作為后續(xù)研究的材料。

抗菌肽A375細(xì)胞IC50值HaCat細(xì)胞IC50值Temporin?1CEa18 20±3 7450 60±3 05LK127 79±4 8148 20±2 41?LK2(5)>100>100LK2(6)95 65±3 0071 87±3 47LK346 25±4 16>100LK2(6)A(L)16 81±1 7945 00±5 17LK2(6)AN(2L)11 48±3 5717 93±2 05?

Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)這3種肽對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制見表2，結(jié)果表明Temporin-1CEa，LK1，LK2(6)A(L)均能夠明顯抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)說明這3種肽具有潛在的抗血管新生的活性。

抗菌肽HUVEC細(xì)胞IC50值Temporin?1CEa30 99±1 31LK126 16±1 25LK2(6)A(L)23 05±2 82

2.2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用于證明細(xì)胞遷移作用，實(shí)驗(yàn)選取2.5、5、10、15、20、25 μM濃度的3種肽作用HUVEC細(xì)胞1 h，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，加肽組隨著肽濃度的增大，細(xì)胞遷移的距離在逐漸減小，遷移出來的細(xì)胞數(shù)量減少，遷移抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1，遷移抑制率隨著肽濃度的增大而增大。

圖1 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)HUVEC細(xì)胞劃痕/遷移的抑制作用(n=3)Fig.1 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in scratch/migration test(n=3)

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞遷移的數(shù)量，隨著肽濃度的增加，從Transwell小室的上室遷移到下表面的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移有抑制作用，遷移抑制率見圖2。

圖2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移/侵襲的抑制作用(n=3)Fig.2 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in migration/invasion test(n=3)

2.3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC細(xì)胞的血管生成能力 通過基質(zhì)膠小管形成的實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)抗菌肽對(duì)HUVEC血管生成的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)膠肽濃度為15 μM時(shí)，HUVEC細(xì)胞形成的網(wǎng)狀數(shù)量均開始減少，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)開始變細(xì)，隨著基質(zhì)膠中肽濃度的逐步提高，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯著減少，存在的完整管腔則幾乎不存在。結(jié)果表明，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)可抑制HUVEC管腔形成，并呈一定的劑量依賴性，管腔抑制率見圖3。

圖3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)HUVEC細(xì)胞基質(zhì)膠小管形成的抑制作用(n=3)Fig.3 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC cell matrigel tubule formation(n=3)

2.4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制A375細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn) 隨著肽濃度的增加，從Transwell小室的上室遷移到下表面的細(xì)胞數(shù)量越來越少，細(xì)胞聚集程度越來越低，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)A375細(xì)胞侵襲的抑制作用在明顯增加，遷移抑制率見圖4。

圖4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)A375細(xì)胞遷移/侵襲的抑制作用(n=3)Fig.4 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on A375 migration in migration/invasion test(n=3)

2.5 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞釋放MMP-2和VEGF的影響 隨著肽濃度的增加，A375細(xì)胞釋放MMP-2的量越來越少，當(dāng)肽濃度達(dá)到15 μM時(shí)，MMP-2的釋放量已低至較低水平，表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)A375細(xì)胞釋放的MMP-2呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。抑制腫瘤細(xì)胞釋放VEGF，則可以有效抑制血管新生，同時(shí)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲。隨著肽濃度的增加，A375細(xì)胞釋放VEGF的越來越少，當(dāng)肽濃度達(dá)到15 μM時(shí)，MMP-2的釋放量已經(jīng)達(dá)到較低水平，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)A375細(xì)胞釋放的VEGF呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制。見圖5。

圖5 ELISA 方法檢測(cè)Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L) 對(duì)A375細(xì)胞中MMP-2和VEGF釋放的影響Fig.5 Effects of Temporin-1CEa、LK1 and LK2(6)A(L) on MMP-2 and VEGF secretion of A375 cells detected by ELISA

3 討論

目前，臨床應(yīng)用的多數(shù)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均存在殺傷作用，副反應(yīng)較多，且容易產(chǎn)生耐藥。黑色素瘤是最常見的皮膚癌類型，占所有的皮膚死亡癌癥的80%以上，其惡性程度高，很容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，尋找到一種不僅能選擇性殺傷黑色素瘤細(xì)胞，還可以成功破壞黑色素瘤細(xì)胞周圍新生血管，并抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移侵襲的新型藥物是非常有意義的[8]。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作對(duì)Temporin-1CEa及其6種改造肽進(jìn)行研究，證實(shí)它們對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用[9]。Temporin-1CEa及其改造肽屬于陽離子α-螺旋膜活性多肽，這類肽作用于細(xì)胞時(shí)，其陽離子凈電荷和兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)更易于與表面負(fù)電荷物質(zhì)多于正常細(xì)胞的癌細(xì)胞膜發(fā)生靜電吸引和結(jié)合[7]，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)甚至形成孔洞，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄。由于這種特殊的作用機(jī)制，使得此類肽可以選擇性地殺傷癌細(xì)胞，對(duì)非腫瘤細(xì)胞毒性較小，且不易產(chǎn)生耐藥。在本文對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)7種肽中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(A)(L) 能夠選擇性抑制A375細(xì)胞增殖，對(duì)HaCat細(xì)胞毒性較小。

實(shí)體腫瘤包括腫瘤組織和基質(zhì)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞通過與基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用營(yíng)造出器官特異性的微環(huán)境，來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]。在沒有新血管生成以前, 腫瘤不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而在新血管生成后腫瘤細(xì)胞不僅會(huì)以更快的速度成倍增長(zhǎng), 轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)也隨之增高[11]。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲不僅需要釋放MMP-2來降解細(xì)胞外基質(zhì)，還通過釋放VEGF來促進(jìn)腫瘤自身新生血管的生成，血管生成的刺激，能夠增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)細(xì)胞分裂，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移侵襲[12-14]。

本研究通過3個(gè)實(shí)驗(yàn)在不同層面反映血管生成的過程，細(xì)胞劃痕遷移模擬了細(xì)胞平面遷移能力，遷移與侵襲模擬了真實(shí)環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性，基質(zhì)膠小管則模擬了血管形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞劃痕/遷移、遷移/侵襲和管腔的形成均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。在A375細(xì)胞的侵襲性實(shí)驗(yàn)中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制A375細(xì)胞在趨化因子的作用下穿過Transwell聚碳酸酯膜。同時(shí)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)還能減少A375細(xì)胞MMP-2和VEGF的釋放。

綜上所述，陽離子抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽基于其特殊的作用機(jī)制對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞產(chǎn)生選擇性的抑制作用，并能抑制與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血管新生和轉(zhuǎn)移侵襲, 這將為陽離子抗菌肽抗血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的機(jī)制研究以及新型抗黑色素瘤多肽藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)和新的思路。

[1] Yilmaz M，Christofori G，Lehembre F.Distinct mechanisms of tumor invasion and metastasis[J].Trends Mol Med, 2007, 13(12):535-541.

[2] Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al.Cancer-related inflammation[J].Carcinogenesis, 2009, 30(7):1073-1081.

[3] Garbe C, Leiter U.Melanoma epidemiology and trends[J].Clin Dermatol, 2009, 27(1):3-9.

[4] Makovitzki A, Fink A, Shai Y.Suppression of human solid tumor growth in mice by intratumor and systemic inoculation of histidine-rich and pH dependent host defense-like lytic peptides[J].Cancer Research, 2009, 8(69):3458-3463.

[5] Neagu M， Constantin C， Zurac S.Immune parameters in the prognosis and therapy monitoring of cutaneous melanoma patients: experience， role， and limitations[J].BioMed Research International, 2013, 2013(1):107940-107952.

[6] Wang C,Li HB,Li S, et al.Antitumor effects and cell selectivity of temporin-1CEa,an antimicrobial peptide from the skin secretions of the Chinese brown frog (Rana chensinensis)[J].Biochimie, 2012, 94(2):434-441.

[7] Wang C, Chen YW,Zhang L,et al.Melanoma cell surface-expressed phosphatidylserine as a therapeutic target for cationic anticancer peptide, temporin-1CEa[J].J Drug Target,2015, DOI: 10.3109/1061186X.2015.1113539.

[8] Huang YB, He LY, Jiang HY, et al.Role of helicity on the anticancer mechanism of action of cationic-helical peptides[J].Int J Mol Sci, 2012, 13(6):6849-6862.

[9] Yang QZ, Wang C, Lang L, et al.Design of potent,non-toxic anticancer peptides based on the structure of the antimicrobial peptide,temporin-1CEa[J].Arch Pharm Res, 2013, 36(11):1302-1310.

[10] Wang C, Tian LL,Li S.Rapid cytotoxicity of antimicrobial peptide temporin-1CEa in breast cancer cells through membrane destruction and intracellular calcium mechanism[J].PLoS ONE, 2013, 90(20-21):1004-1014.

[11] Steinstraesser L, Hauk J, Schubert C et al.Suppression of soft tissue sarcoma growth by a host defense-like lytic peptide[J].PLoS One, 2011, 6(3):18321.

[12] Mantovani A, Allavena P, Sica A and Balkwill F.Cancer related inflammation[J].Nature, 2008, 454(7203):436-444.

[13] Whiteside TL.The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth[J].Oncogene, 2008, 27(45):5904-5912.

[14] 王拴柱,馬秀梅.細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(1):76-80.

(編校：王冬梅)

Study on inhibitory effect of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues inhibit metastasis and invasion of human melanoma A375 cells and reduce angiogenesis

REN Hui-dan1, ZHANG Lin1?, ZHAO Ying1, SI Xin-hong1, ZHANG Liang1, WANG Che1,2Δ

(1. Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Key Laboratory of Biotechnology and Molecular Drug Development in Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo screen the inhibitory effects of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues on human melanoma A375 cells proliferation. And to evaluate their impacts on A375 cells metastasis and invasion and their angiogenesis reduction activity in vitro further.MethodsCell proliferation inhibition ratio was detected by MTT assay. The ability of migration/invasion was determined by wound/healing test and transwell test. Tubule formation assay was performed to investigate the effects of peptides on angiogenesis. The release of MMP-2 and VEGF was detected by ELISA.ResultsMTT results indicated that Temporin-1CEa and two of its analogues, LK1 and LK2(6)A(L), significantly inhibited A375 cells proliferation without significant cytotoxicity to human keratinocyte HaCaT cells. Moreover, the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was also inhibited by these peptides, suggesting an angiogenesis inhibitory activity. The data from HUVEC wound/healing test, transwell test and tubule formation assay further confirmed the migration inhibition and angiogenesis reduction activities of these three peptides, in a dose-dependent manner. In addition, these peptides also inhibited the migration of A375 cells in transwell test. Consistently, the ELISA data further supported that the metastasis/invasion inhibitory activities and angiogenesis reduction potential of temporin-1CEa and their analogues on A375 cells might be due to the decreased MMP-2 and VEGF secretion.ConclusionTemporin-1CEa and its analogues not only exerte potent and selective cytotoxicity to A375 cells, but also inhibite A375 cells metastasis and invasion and reduce angiogenesis, therefore, have the potential to be a new type anti-melanoma drugs.

antimicrobial peptides; melanoma; angiogenesis; metastasis; invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金(81202448)；國(guó)家級(jí)和遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510165004)

任會(huì)丹，女，本科在讀，研究方向：藥學(xué)，E-mail：641769183@qq.com；共同第一作者，張琳，女，碩士在讀，研究方向：抗菌肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用機(jī)制，E-mail：1165487541@qq.com；王澈，通信作者，女，博士，碩士生導(dǎo)師、副教授，研究方向：天然藥物抗腫瘤機(jī)制研究及應(yīng)用，E-mail：wangche126@126.com。

R963

A

1005-1678(2016)02-0019-04