古小彬，朱俊揚(yáng)，王保健，鄭　晶，楊光友，汪　濤，賴為民

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611133；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，成都 610041)

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四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1/2)序列的遺傳變異分析

古小彬1#*，朱俊揚(yáng)1#，王保健1，鄭晶2，楊光友1，汪濤1，賴為民1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611133；2.四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，成都 610041)

摘要：探討四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)(Heterakisgallinarum)的遺傳變異情況，為該地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)病的流行特征及防控提供基礎(chǔ)資料。采用PCR擴(kuò)增四川7個(gè)地區(qū)共59個(gè)雞源雞異刺線蟲(chóng)核糖體ITS1-5.8S-ITS2片段并測(cè)序，所得序列剪切5.8S序列后，得到ITS1/2序列，并分析ITS1/2序列的遺傳多樣性；同時(shí)利用GenBank中已公布的異刺屬(Heterakis)ITS1/2序列信息，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。結(jié)果如下：59條雞異刺線蟲(chóng)ITS1/2序列相似性較高(98.9%～100.0%)，ITS1序列間變異較ITS2大；59條序列有20個(gè)變異位點(diǎn)和14個(gè)單倍型(H1～H14)；四川種群具有豐富的單倍型多樣性(Hd=0.532)和較低的核苷酸多樣性(π=0.000 94)；種群間基因交流頻繁(Nm=31.72)，群體遺傳分化不明顯(Fst=0.007 82)，以群體內(nèi)變異為主(AMOVA分析值=99.22%)；從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及進(jìn)化樹(shù)(MP和ML)分析來(lái)看，7個(gè)地理種群未形成顯著的地理種群結(jié)構(gòu)，但四川整體種群曾經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張(Tajima’sD=-2.553 31，F(xiàn)u’sFs=-10.564；P<0.05)；進(jìn)化樹(shù)(MP和ML)能有效區(qū)分雞異刺線蟲(chóng)與屬內(nèi)其他蟲(chóng)種。四川7個(gè)地區(qū)雞的雞異刺線蟲(chóng)基因交流頻繁，遺傳多樣性較低。

關(guān)鍵詞：雞異刺線蟲(chóng)；四川；ITS1/2 序列；遺傳多樣性

雞異刺線蟲(chóng)(Heterakisgallinarum)是大多數(shù)家禽及一些野生鳥(niǎo)禽類動(dòng)物盲腸內(nèi)最常見(jiàn)的線蟲(chóng)之一[1]，呈世界性分布。我國(guó)多個(gè)地區(qū)均有雞異刺線蟲(chóng)感染報(bào)道，各地感染率為20.30%～76.60%[2-4]。雞異刺線蟲(chóng)除引起宿主發(fā)病和死亡外，還可作為高感染率和高死亡率的火雞組織滴蟲(chóng)病(又稱黑頭病，histomoniasis)的重要傳播載體[5]。因此，雞異刺線蟲(chóng)在養(yǎng)殖業(yè)和野生鳥(niǎo)禽類保護(hù)中具有重要意義。

寄生蟲(chóng)同種物種的不同地理種群，由于地理隔離以及對(duì)各自特異的生態(tài)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)，最終形成了地理種群間的種質(zhì)差異，從而導(dǎo)致不同蟲(chóng)株的感染力、藥物敏感性以及流行病學(xué)等特征的差異[6]。而核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)具有長(zhǎng)度適中和較高的進(jìn)化速率等特點(diǎn)，不僅在種間存在較大的變異性，在同一物種的不同地理種群中也存在著明顯的差異性，可用于比較種內(nèi)群體之間的遺傳變異[7]。

目前，ITS序列作為分子標(biāo)記已經(jīng)成功地應(yīng)用于雞異刺線蟲(chóng)的分子分類鑒定[5]。然而對(duì)于不同地理來(lái)源雞異刺線蟲(chóng)的遺傳變異情況，有無(wú)遺傳分化等種群遺傳特征仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于核糖體的2個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS1/2序列)分析了四川7個(gè)地區(qū)共59個(gè)雞源雞異刺線蟲(chóng)分離株的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)等特征，為進(jìn)一步了解四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)病的流行特征及防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

采用循序沉淀法[8]從雞盲腸內(nèi)分離收集蟲(chóng)體，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定[9]為雞異刺線蟲(chóng)，于-20 ℃冰箱保存待用。從四川7個(gè)地區(qū)共采集到59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)樣本，樣本編號(hào)為雅安(YA1～YA9)、西昌(XC1～XC8)、綿陽(yáng)(MY1～MY9)、達(dá)州(DZ1～DZ10)、成都(CD1～CD6)、廣元(GY1～GY7)及自貢(ZG1～ZG10)(圖1)。

括號(hào)里的數(shù)字為標(biāo)注的每個(gè)地區(qū)所采集的樣品數(shù)量The numbers of H.gallinarum isolates are shown in each region圖1　四川7個(gè)地區(qū)所采集的59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)分布Fig.1　The geographical location of 59 Heterakis gallinarum isolates collected from 7 different geographical regions of the Sichuan province，China

1.2基因組DNA的提取

將凍存的各地雞異刺線蟲(chóng)1條置于預(yù)冷研缽中，加入200 μL 的蟲(chóng)體裂解緩沖液快速研碎蟲(chóng)體，隨后加入適量蛋白酶K消化蟲(chóng)體過(guò)夜，隨后采用酚/氯仿法提取雞異刺線蟲(chóng)的DNA[10]，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3ITS 基因的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

采用保守引物擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2序列[7]，引物序列如下，NC5-ITS-R：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；NC2-ITS-F：5′-TTAG-TTTCTTTTCCTCCGCT-3′。擴(kuò)增體系如下(25 μL)：上、下游引物(20 pmol) 各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊至體系25 μL；且以ddH2O為空白對(duì)照；上述試劑混合后瞬時(shí)離心。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，49 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠中條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符的膠塊切割下來(lái)，移入1.5 mL 滅菌離心管中，根據(jù)TIANGEN公司的DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書純化回收。純化回收的產(chǎn)物克隆入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，以菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。將PCR陽(yáng)性菌液送往英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1序列特征分析根據(jù)峰圖對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)，所有序列經(jīng)比對(duì)和編輯后得到對(duì)應(yīng)的ITS1/2序列。利用Clustal W 1.81分析四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)ITS1/2序列的變異位點(diǎn)。 MEGA 5.0軟件計(jì)算各堿基(A、T、C、G)的組成含量。采用DNAStar中的MegAlign程序?qū)λ鶞y(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的異刺屬(Heterakis)ITS1/2序列進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析(表1)。

表1異刺屬ITS序列信息

Table 1Information of ITS sequences ofHeterakisin GenBank

物種Species地理分布GeographicalDistribution基因Gene序列號(hào)GenBankNo.HeterakisgallinarumSichuan四川ITSKT310099～KT310157(本研究Thisstudy)H.gallinarumGuangzhou廣州ITSAJ876757H.gallinarumGuangzhou廣州ITSAJ876758H.gallinarumAustralia澳大利亞ITS1AJ007453H.gallinarumAustralia澳大利亞ITS2AJ007454H.gallinarumAmerica美國(guó)ITSJQ995320H.spumosaSpain西班牙ITSJX845278H.dahomensisSenegal塞內(nèi)加爾ITSJX845277H.isoloncheChina中國(guó)ITSKM212953

1.4.2遺傳多樣性分析運(yùn)用DnaSP 5.0軟件計(jì)算種群的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)(haplotypes)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)和單倍型多樣性(Haplotypes diversity，Hd)。采用MEGA 5.0軟件計(jì)算單倍型間的遺傳距離(基于Kimura 2-parameter模型)。

1.4.3遺傳結(jié)構(gòu)及中性檢驗(yàn)分析采用Tcs 1.21軟件構(gòu)建單倍型簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖。Arlequin 3.1軟件中的分子變異分析(AMOVA)和種群間的遺傳差異分析(Fst)了解四川地區(qū)的遺傳結(jié)構(gòu)；基因流(Nm)由Nm=1/4(1/Fst-1)計(jì)算；同時(shí)計(jì)算種群的中性檢驗(yàn)值(Tajima’sD和Fu’sFs)。

1.4.4異刺屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建選用雞蛔蟲(chóng)(Ascaridiagalli)ITS1/2序列(GenBank No.：AJ007451)作為外群，MEGA 5.0軟件中的最大簡(jiǎn)約法(MP)和最大似然法(ML)構(gòu)建異刺屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行重復(fù)1 000次的自舉檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1序列基本特征

成功擴(kuò)增59個(gè)樣品的序列，序列長(zhǎng)度為1 067或1 068 bp的序列(GenBank No.：KT310099～KT310157)。經(jīng)比對(duì)和編輯后，59個(gè)樣品的ITS1序列的長(zhǎng)度有428或427 bp兩種，5.8S序列均為157 bp，ITS2序列均為386 bp。其中59個(gè)樣品的5.8S序列沒(méi)有檢測(cè)到變異位點(diǎn)，其序列相似性為100%。剪切5.8S序列后，將ITS1和ITS2序列串聯(lián)得到ITS1/2序列，其總長(zhǎng)度為814或813 bp。59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)分離株的ITS1/2序列共檢測(cè)出20個(gè)變異位點(diǎn)(占2.46%)，包括17個(gè)單變異位點(diǎn)和3個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。其中14個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，6個(gè)顛換位點(diǎn)，7個(gè)樣品在第19位點(diǎn)存在堿基缺失(表2)。A、T、C、G堿基的平均含量分別為25.6%、32.3%、18.1%、24.0%，A+T堿基含量為57.9%，高于G+C的堿基含量42.1%。

2.2ITS1/2序列相似性分析

研究所得的59條雞異刺線蟲(chóng)ITS1/2序列間相似性為98.9%～100%，ITS1間與ITS2間序列相似性分別為98.4%～100%和99.0%～100%。本研究中的雞異刺線蟲(chóng)四川株(59條)與廣州株(GenBank No.：AJ876757，AJ876758)、澳大利亞株(GenBank No.：AJ007453，AJ007454)、美國(guó)株(GenBank No.：JQ995320)的序列相似性較高(ITS1/2序列：99.3%～99.8%、98.9%～99.5%、96.4%～97.0%；ITS1序列98.8%～99.8%、98.1%～99.1%和92.5%～93.7%；ITS2序列99.2%～99.7%)。

本研究所得的雞異刺線蟲(chóng)(H.gallinarum)(59條)與H.spumosa(GenBank No.：JX845278)、H.dahomensis(GenBank No.：JX845277)、H.isolonche(GenBank No.：KM212953)序列間相似性較低(ITS1/2序列：61.1%～61.9%、60.8%～61.2%、67.5%～68.1%；ITS1序列：73.1%～74.0%、74.6%～75.5%、78.1%～79.2%；ITS2序列：50.6%～51.0%、46.7%～47.3%、59.1%～59.5%)。

2.3種群遺傳多樣性分析

四川地區(qū)59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)分離株的ITS1/2序列共檢測(cè)出14個(gè)單倍型(H1～H14)，單倍型H1被7個(gè)地理種群的40個(gè)蟲(chóng)株所共享(占67.8%)；雅安株(YA4)、綿陽(yáng)株(MY4、MY8)、達(dá)州株(DZ8)、成都株(CD1)和自貢株(ZG1、ZG6)共享單倍型H2。除成都種群外，其余6個(gè)種群都有各自特有的單倍型。四川整體種群的核苷酸多樣性(π)為0.000 94，單倍型多樣性(Hd)為0.532。四川7個(gè)地理種群中，西昌種群的π最高(0.001 84)，而雅安種群的Hd最高(0.722)，成都種群的π和Hd最低(0.000 00和0.333)(表3)。14個(gè)單倍型的遺傳距離為0.001～0.011，平均遺傳距離為0.004。

表3基于ITS1/2序列的四川7地雞異刺線蟲(chóng)種群遺傳多樣性指數(shù)

Table 3Genetic diversity indexes ofHeterakisgallinarumpopulations from the 7 different geographical regions in Sichuan，calculated from the ITS1/2 sequences

種群Population樣品數(shù)量No.ofsample單倍型數(shù)No.ofhaplotypes單倍型多樣性Haplotypediversity(Hd)核苷酸多樣性Nucleotidediversity(π)雅安YA9(YA1-YA9)5(H1～H5)0.7220.00123西昌XC8(XC1-XC8)3(H1,H6～H7)0.4640.00184綿陽(yáng)MY9(MY1-MY9)3(H1,H2,H8)0.5560.00109達(dá)州DZ10(DZ1-DZ10)4(H1,H2,H9,H10)0.5330.00049廣元GY7(GY1-GY7)3(H1,H11,H12)0.5240.00140成都CD6(CD1-CD6)2(H1,H2)0.3330.00000自貢ZG10(ZG1-ZG10)4(H1,H2,H13,H14)0.6440.00049四川整體種群SC5914(H1～H14)0.5320.00094

YA.Ya’an;XC.Xichang;MY.Mianyang;DZ.Dazhou;GY.Guangyuan;CD.Chengdu;ZG.Zigong;SC.Sichuan.The same as below

2.4種群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建基于14個(gè)單倍型構(gòu)建的單倍型簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單(圖2)。單倍型H1位于單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的中心，為主要單倍型，其余單倍型圍繞H1呈輻射狀。單倍型間的突變從1步到4步不等。其中H2、H4、H5和H6、H11分別形成2個(gè)不同的分支，2個(gè)分支均未形成地理聚類。

2.4.2遺傳分化和中性檢驗(yàn)值A(chǔ)MOVA分子變異分析顯示四川種群內(nèi)的遺傳變異是總變異的主要來(lái)源(99.22%)，僅有0.78%的變異發(fā)生在7個(gè)種群間。7個(gè)種群間的Fst值為-0.058 82～0.047 82(表4)，均處于較低的分化水平。四川整體種群的總Fst值為0.007 82，總基因流(Nm)為31.72，說(shuō)明四川種群內(nèi)的基因交流非常充分，不存在明顯的遺傳分化。

從中性檢驗(yàn)值來(lái)看，四川整體種群的Tajima’sD值為-2.553 31(P<0.05)，F(xiàn)u’sFs值為-10.564(P<0.05)。四川7個(gè)地理種群的Taji-ma’sD值為-1.639 82～0.000 00，其中僅西昌種群和綿陽(yáng)種群差異顯著；而Fu’sFs值為-2.979 11～0.971 41，其中雅安種群、達(dá)州種群和自貢種群差異顯著(表5)。

圓圈的大小與單倍型的分布頻率成正比；不同顏色代表來(lái)自不同種群的單倍型。YA.雅安；XC.西昌；MY.綿陽(yáng)；DZ.達(dá)州；GY.廣元；CD.成都；ZG.自貢The Circle sizes are proportional to the number of isolates.The different colours represent haplotypes from the different populations.YA.Ya’an；XC.Xichang；MY.Mianyang；DZ.Dazhou；GY.Guangyuan；CD.Chengdu；ZG.Zigong圖2　雞異刺線蟲(chóng)14個(gè)單倍型構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2　A network map of the 14 haplotypes in Heterakis gallinarum

2.5異刺屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

基于本研究中得到的雞異刺線蟲(chóng)(H.gallinarum)14個(gè)單倍型ITS1/2序列、GenBank報(bào)道的廣州株、澳大利亞株、美國(guó)株雞異刺線蟲(chóng)、H.spumosa、H.dahomensis、H.isolonche的ITS1/2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(MP和ML)，構(gòu)樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，MP樹(shù)和ML樹(shù)具有非常相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，不同地理來(lái)源的雞異刺線蟲(chóng)(H.gallinarum)聚為一分支，H.spumosa和H.dahomensis形成一個(gè)分支，而H.isolonche單獨(dú)位于另一個(gè)分支。

3討論

我國(guó)是世界養(yǎng)禽大國(guó)，養(yǎng)禽業(yè)從早期的單一自給、半自給性的農(nóng)民家庭庭院模式，逐漸演變成規(guī)?；默F(xiàn)代集約養(yǎng)殖、庭院養(yǎng)殖及山林養(yǎng)殖等多元化養(yǎng)殖模式。寄生蟲(chóng)是養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)疾病，種類多，分布廣泛，危害嚴(yán)重，而雞異刺線蟲(chóng)是禽類腸道中最常見(jiàn)的線蟲(chóng)之一，我國(guó)各地均有該寄生蟲(chóng)的報(bào)道，禽類感染率為20.30%～76.60%[2-4]。據(jù)作者調(diào)查，四川地區(qū)的雅安、西昌、綿陽(yáng)、達(dá)州、成都、廣元及自貢7地的雞異刺線蟲(chóng)感染率為23.3%～57.6%，而這7地屬于成都平原或大巴山系、大涼山系等山系，這些山系間有大渡河、青衣江等眾多江河，水系發(fā)達(dá)，從而形成天然屏障，將這7個(gè)地區(qū)進(jìn)行隔離；而源自這7地的雞異刺線蟲(chóng)會(huì)不會(huì)因山系、河流等地理隔離而出現(xiàn)地理種群間的種質(zhì)差異呢？帶著這個(gè)疑問(wèn)，作者分析了四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)群體遺傳多態(tài)性。

表4四川雞異刺線種群間ITS1/2序列的遺傳分化度

Table 4Pairwise fixation index (Fstvalues) ofHeterakisgallinarumpopulations in Sichuan，calculated from nucleotide sequences derived from the ITS1/2 sequences

地區(qū)Region雅安YA西昌XC綿陽(yáng)MY達(dá)州DZ廣元GY成都CD自貢ZG雅安YA—西昌XC0.02779—綿陽(yáng)MY0.031250.00384—達(dá)州DZ0.047820.016310.00454—廣元GY0.00134-0.030210.004310.02378—成都CD0.00552-0.04025-0.05109-0.05882-0.02439—自貢ZG0.047820.016310.004540.00000-0.02439-0.02439—

表5雞異刺線蟲(chóng)種群ITS1/2序列中性檢測(cè)指數(shù)

Table 5The index of neutrality test ofHeterakisgallinarumITS1/2 sequences

種群PopulationFu’sFsTajima’sD雅安YA-2.97911*-0.93613西昌XC0.97141-1.63982*綿陽(yáng)MY0.13355-1.60974*達(dá)州DZ-2.88102*-1.40085廣元GY0.26326-1.43414成都CD0.000000.00000自貢ZG-2.88102*-1.40085四川整體種群SC-10.564*-2.55331*

*.P<0.05

Ascaridia galli 作為外群；AUS.澳大利亞；USA.美國(guó)；GZ.廣州Ascaridia galli as the outgroup.AUS.Australia；USA.United States of America；GZ.Guangzhou圖3　基于異刺屬ITS1/2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　The phylogenetic trees by Maximum-parsimony (MP and ML) were constructed based on the ITS 1/2 sequences of the genus Heterakis

3.1序列差異分析

雞異刺線蟲(chóng)種內(nèi)的ITS1/2序列相似性(96.4%～100%)顯著高于種間(與H.spumosa、H.dahomensis、H.isolonche)的序列相似性(60.8%～68.1%)，表明ITS1/2序列在種內(nèi)更為保守。雖然雞異刺線蟲(chóng)的ITS1/2序列水平上具有較高的相似性，但不同地理來(lái)源蟲(chóng)株的ITS1/2序列也存在一定的差異，其中四川株與美國(guó)株的相似性(96.4%～97.0%)明顯小于其與廣州株和澳大利亞株的相似性(99.3%～99.8%和98.9%～99.5%)。另外，59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)樣本的ITS1和ITS2的變異也存在明顯的差異，變異位點(diǎn)在ITS1和ITS2中分別有13個(gè)和7個(gè)，堿基缺失僅出現(xiàn)于ITS1上。四川株與廣州株、澳大利亞株和美國(guó)株的雞異刺線蟲(chóng)ITS1變異均大于ITS2，進(jìn)一步支持了呂召宏等[11]的結(jié)果。Heterakis屬內(nèi)不同種比較時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)ITS2較ITS1表現(xiàn)出更高的變異性，進(jìn)一步支持了A.Ribas等[1]的結(jié)果，他認(rèn)為H.dahomensis和H.spumosa的ITS2基因(3.12%±0.83%)進(jìn)化分歧顯著高于ITS1(0.97%±0.47%)，表明ITS2在種間變異性更大。因此，作者認(rèn)為雞異刺線蟲(chóng)種內(nèi)的ITS1比ITS2的變異性更大，而ITS2在種間具有更高的變異性。

3.2遺傳多樣性分析

種群的遺傳多樣性是種群活力的基礎(chǔ)，是物種適應(yīng)環(huán)境變化、維持長(zhǎng)期生存和進(jìn)化的保證，學(xué)者們多采用核苷酸多樣性(π)和單倍性多樣性(Hd)來(lái)衡量種群的遺傳多樣性，這2個(gè)指標(biāo)可反映物種遺傳多樣性的高低[12]。由于1個(gè)堿基的變異就能生成1個(gè)新的單倍型，因此Hd可在短時(shí)間內(nèi)積累變異而快速提高，但對(duì)π的影響卻很小，π值的提高需要長(zhǎng)時(shí)間的積累，因此π在衡量種群遺傳多樣性時(shí)比Hd更具有代表性[13]。

從本研究來(lái)看，四川59個(gè)雞異刺線蟲(chóng)株有14個(gè)單倍型(H1～H14)，其中單倍型H1在7個(gè)地理種群中均有分布，這種單倍型可認(rèn)為是能夠適應(yīng)環(huán)境變化并在種群中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢(shì)單倍型，推測(cè)H1是最原始的單倍型[14]。四川7個(gè)地區(qū)比較發(fā)現(xiàn)，除成都種群外，其余6個(gè)地區(qū)種群都有各自所特有的單倍型，且成都地區(qū)Hd也是7個(gè)地區(qū)最低水平(0.333)，這可能與成都地區(qū)屬于平原地區(qū)，其地勢(shì)平坦，外環(huán)境中雞異刺線蟲(chóng)的感染性蟲(chóng)卵較容易傳播到平原其他地區(qū)感染新宿主有關(guān)。從單倍型個(gè)數(shù)和四川整體種群的Hd(0.532)來(lái)看，四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)的單倍型多樣性相對(duì)較為豐富，而核苷酸多樣性的結(jié)果卻與單倍型多樣性相反，其值均較低(小于0.01)，這可能是由于雞異刺線蟲(chóng)種群歷史上出現(xiàn)過(guò)瓶頸效應(yīng)，經(jīng)歷了快速的種群擴(kuò)張，種群通過(guò)變異形成了較高的單倍型多樣性，但因擴(kuò)張時(shí)間較短尚未能積累較高的核苷酸多樣性水平[15]。而Tajima’sD值和Fu’sFs值(負(fù)值且差異顯著)又進(jìn)一步支持了四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)種群曾經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張的推測(cè)[16-17]。

3.3遺傳結(jié)構(gòu)分析

四川整體種群的遺傳分化指數(shù)(Fst)(0.007 82)和基因流值(31.27)反映出四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)種群的基因交流非常頻繁，種群間的遺傳分化程度較低[18-19]。同時(shí)，除成都種群外，各地種群都擁有各自特有的單倍型，表明四川地區(qū)不同地理種群間的ITS基因仍存在一定的遺傳分化，但是總體來(lái)說(shuō)遺傳分化不顯著。此外，AMOVA分子變異分析亦表明雞異刺線蟲(chóng)種群間的遺傳變異較小(0.78%)。從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可見(jiàn)，7個(gè)地理種群的單倍型并沒(méi)有據(jù)地理來(lái)源形成明顯的地理性聚類，表明四川地區(qū)的7個(gè)雞異刺線蟲(chóng)種群還未形成顯著的地理種群遺傳結(jié)構(gòu)。

雞異刺線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中不需要中間宿主，雌蟲(chóng)所產(chǎn)蟲(chóng)卵隨宿主糞便排至外環(huán)境，在外環(huán)境中孵化至含二期幼蟲(chóng)的蟲(chóng)卵后方可感染禽類，由此可見(jiàn)，外環(huán)境中的異刺線蟲(chóng)發(fā)育階段本身沒(méi)有移動(dòng)擴(kuò)散能力。本研究中的四川7地被山脈、河流等隔離形成了物種基因交流的天然地理屏障，加之外環(huán)境中雞異刺線蟲(chóng)發(fā)育階段自身移動(dòng)能力有限，不會(huì)引起物種間的高頻率基因交流，但從本研究結(jié)果來(lái)看，這7地雞異刺線蟲(chóng)的基因交流卻非常頻繁，究其原因可能有：(1)雞異刺線蟲(chóng)除寄生于雞之外，尚可寄生于紅腹錦雞、孔雀、環(huán)頸雉等野生鳥(niǎo)禽類，其可隨鳥(niǎo)類的飛行被帶到其他區(qū)域，從而逾越自然的地理屏障。再加上雞異刺線蟲(chóng)生活史簡(jiǎn)單，不需要中間宿主，因此被鳥(niǎo)類帶到另外一個(gè)新的環(huán)境中后容易感染宿主。而以往的研究報(bào)道亦證實(shí)宿主移動(dòng)影響了寄生蟲(chóng)基因交流，多宿主寄生蟲(chóng)的基因交流水平高于單宿主寄生蟲(chóng)[20-22]。(2)四川各地人民喜食雞肉，而雞的養(yǎng)殖規(guī)模分布不均，導(dǎo)致四川各地區(qū)雞的貿(mào)易頻繁，可將雞異刺線蟲(chóng)隨貿(mào)易交易從一個(gè)地區(qū)帶到另外一個(gè)地區(qū)，從而跨越地理屏障。另外，種群間的基因交流可加速或減緩寄生蟲(chóng)對(duì)藥物的耐藥性，這點(diǎn)在毛圓線蟲(chóng)和尖音庫(kù)蚊(Culexpipiens)中亦得到證實(shí)[20，23]。四川地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)種群間頻繁的基因交流是否會(huì)導(dǎo)致這些地區(qū)雞異刺線蟲(chóng)地理種群間耐藥基因的傳遞還有待進(jìn)一步研究；同時(shí)不同地理種群間的火雞組織滴蟲(chóng)(雞異刺線蟲(chóng)為傳播媒介)的耐藥基因是否會(huì)隨雞異刺線蟲(chóng)基因交流而傳遞仍有待解答。

3.4系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

兩種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常相似的MP和ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，異刺屬(Heterakis)線蟲(chóng)均可與作為外群的雞蛔蟲(chóng)(A.galli)予以鑒別。各地的雞異刺線蟲(chóng)株聚類形成一分支，與同屬的H.spumosa、H.dahomensis和H.isolonche能顯著區(qū)分，其中H.isolonche與雞異刺線蟲(chóng)較另外2種異刺屬線蟲(chóng)的親緣關(guān)系更近，這可能是因?yàn)殡u異刺線蟲(chóng)和H.isolonche均寄生于禽類，而H.spumosa和H.dahomensis寄生于嚙齒類動(dòng)物[1，24]有關(guān)，進(jìn)一步推測(cè)宿主因素對(duì)ITS1/2序列也存在一定的影響。

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(編輯白永平)

Genetic Variation of Heterakis gallinarum in Sichuan based on the Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Regions (ITS1/2)

GU Xiao-bin1#*，ZHU Jun-yang1#，WANG Bao-jian1，ZHENG Jing2，YANG Guang-you1，WANG Tao1，LAI Wei-min1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611133，China；2.SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Chengdu610041，China)

Abstract:The aim of the present study was to analyze the characteristic of genetic variability inHeterakisgallinarumpopulations from Sichuan province，and provide a foundation for understanding the epidemiology and assist in the control of heterakiasis.The nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region (ITS1-5.8S-ITS2) of 59H.gallinarumisolates from chickens belonged to 7 different geographical regions were amplified using the polymerase chain reaction (PCR) and then sequenced.Sequences unit containing ITS1 and ITS2 (excepting 5.8S) were used to determine the genetic variability and genetic structure ofH.gallinarumin Sichuan province，China.Meanwhile，the relationships of this nematode with selected members of genusHeterakiswere assessed by phylogenetic analysis of ITS1/2 sequence datasets by maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML).Results showed that 59H.gallinarumITS1/2 sequences identity ranged from 98.9% to 100.0%，and ITS1 sequences displayed greater variability than ITS2.Fifty-nine sequences contained 20 variable sites，and were classified into 14 haplotypes (H1-H14).The overall Sichuan population showed high haplotype diversity (Hd= 0.532) and low nucleotide diversity (π=0.000 94).Meanwhile，a frequency of gene flow (Nm=31.72)，a low degree of genetic differentiation (Fst=0.007 82)，and an overwhelming genetic variability (99.22%) were observed within the overall Sichuan population.Phylogenetic trees (MP and ML) and haplotype network were both revealed that 7 different geographical regions did not form significant geographical populations.The different species within genusHeterakiswere well distinguished in phylogenetic trees (MP and ML).Our results indicate that there is a high gene flow and low degree of genetic diversity acrossH.gallinarumpopulation.

Key words:Heterakisgallinarum；Sichuan；ITS1/2 sequences；genetic variation

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.020

收稿日期：2015-10-20

基金項(xiàng)目：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科“雙支計(jì)劃”(SC-03571357)

作者簡(jiǎn)介：古小彬(1982-)，女，四川自貢人，副教授，主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病學(xué)研究；朱俊揚(yáng)(1990-)，男，四川成都人，碩士，主要從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病學(xué)研究。#對(duì)本研究具有同等貢獻(xiàn)，并列第一作者 *通信作者：古小彬，副教授，碩導(dǎo)， E-mail: guxb121@126.com

中圖分類號(hào)：S852.731

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0796-09