張　振，馮　宇，張　閣，朱良全，蔣　卉，丁家波*，趙　鵬，常維山*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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副結(jié)核分枝桿菌MAP0862蛋白的表達(dá)及在間接ELISA中的初步應(yīng)用

張振1，2，馮宇1，張閣2，朱良全2，蔣卉2，丁家波2*，趙鵬1，常維山1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

摘要：本研究的目的是探索副結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白MAP0862在牛副結(jié)核病血清學(xué)診斷中的作用，建立牛副結(jié)核病特異性ELISA診斷方法。將通過原核表達(dá)獲得的副結(jié)核特異性蛋白MAP0862純化并定量后作為包被抗原，經(jīng)過一系列條件優(yōu)化后初步建立了牛副結(jié)核病間接ELISA診斷方法。使用牛副結(jié)核陽性血清、牛布病陽性血清、牛結(jié)核陽性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大腸桿菌陽性血清以及健康陰性牛血清對(duì)該方法的驗(yàn)證表明其具有良好的特異性。使用該方法對(duì)300份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法與IDEXX副結(jié)核檢測(cè)試劑盒的符合率為94.3%?；诟苯Y(jié)核特異性蛋白質(zhì)MAP0862建立的間接ELISA診斷方法能有效檢測(cè)牛副結(jié)核病。

關(guān)鍵詞：牛副結(jié)核??；MAP0862蛋白；ELISA

副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP)能引起反芻動(dòng)物以慢性腸炎為特征的副結(jié)核病(Johne’s病)，該病于1958年和1959年首次報(bào)道出現(xiàn)在地中海塞浦路斯的一個(gè)牛場(chǎng)中[1]，同期我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)也首次報(bào)道了一例副結(jié)核病牛，該病在隨后的幾年內(nèi)迅速蔓延至全國(guó)大部分地區(qū)[2]。由于該病引起奶牛嚴(yán)重消瘦和生產(chǎn)性能下降，給奶牛生產(chǎn)帶來了極大的損失[3]，該病僅在美國(guó)動(dòng)物性食品方面的損失每年就可達(dá)到2.5億美元[4]。副結(jié)核病不僅關(guān)系到畜牧業(yè)發(fā)展，而且對(duì)人類健康也構(gòu)成威脅，最近有研究推測(cè)該菌與人類的克羅恩病相關(guān)，然而目前尚無治療該病的特效治療藥物或方法，因此引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注[5]。牛副結(jié)核病在我國(guó)也相當(dāng)嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)室與山東奶牛中心連續(xù)3年對(duì)全國(guó)16個(gè)省份的28個(gè)牧場(chǎng)進(jìn)行過牛副結(jié)核病和布魯菌病的檢測(cè)，其中副結(jié)核病的群體陽性率高達(dá)14.3%。

經(jīng)典的副結(jié)核病診斷采用禽結(jié)核菌素進(jìn)行皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，檢測(cè)過程中至少需要2次固定牛，工作量非常大，加之禽結(jié)核分枝桿菌與其他分枝桿菌具有較高的同源性，易導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，從而使牛副結(jié)核病的確診變得困難。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效的副結(jié)核病檢測(cè)方法用于對(duì)牛副結(jié)核病診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

MAP0862為副結(jié)核分枝桿菌的特有抗原，在其他分枝桿菌中缺乏，且該蛋白質(zhì)在副結(jié)核分枝桿菌中高水平表達(dá)，可引發(fā)動(dòng)物機(jī)體體液免疫，具有良好的免疫原性。國(guó)內(nèi)已有對(duì)該蛋白質(zhì)體外表達(dá)的研究報(bào)道，但未研究其在ELISA方面的應(yīng)用。本研究旨在對(duì)副結(jié)核MAP0862基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并嘗試建立副結(jié)核特異的血清學(xué)診斷方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及載體副結(jié)核分枝桿菌P10，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物保藏中心。原核表達(dá)載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑副結(jié)核培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司；E.coliBL21(DE3) 、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase購(gòu)自TaRaKa公司；超保真2×Master Mix購(gòu)自NEB公司；基因組提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司：質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)抗體購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3試驗(yàn)血清副結(jié)核病陽性牛血清18份、布病陽性牛血清10份、牛結(jié)核陽性血清15份、卡介苗免疫牛血清10份、牛陰性血清58份均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；300份臨床牛血清中200份由山東省奶牛中心提供，100份由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1菌種復(fù)蘇無菌開啟一支凍存的副結(jié)核分枝桿菌P10菌種，用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體后接種于兩支副結(jié)核培養(yǎng)基，置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)約30 d至長(zhǎng)出白色顆粒狀菌落。1.2.2引物設(shè)計(jì)從GenBank調(diào)取副結(jié)核分枝桿菌K-10 的MAP0862基因序列(檢索號(hào)：AE016958.1)，使用DNAStar軟件分析該序列中抗原性最好的一段區(qū)域(1 032 bp)并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增該片段。P1：5′-CCGGAATTCATGCGCTTCGTAAA-CGG-3′(含EcoRⅠ位點(diǎn))；P2：5′-CCGCTCGAG-TTATGGCTTCCTCGTAAA-3′(含XhoⅠ位點(diǎn))。

1.2.3MAP0862基因擴(kuò)增使用基因組提取試劑盒提取副結(jié)核分枝桿菌P10的基因組作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×Master Mix 25 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，基因組2 μL，加滅菌ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s(30個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min 延伸PCR反應(yīng)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

1.2.4重組表達(dá)質(zhì)粒pET-MAP0862的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)使用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)回收的PCR產(chǎn)物以及pET-32a(+)載體進(jìn)行雙酶切，使用T4 DNA Ligase對(duì)回收后的雙酶切產(chǎn)物按一定比例進(jìn)行過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)后挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，挑取酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送公司測(cè)序鑒定。將含陽性重組質(zhì)粒的菌液按照1∶100比例接種新鮮含氨芐抗性(100 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌至OD600 nm=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)4 h后離心收集菌體。

1.2.5SDS-PAGE凝膠電泳以及可溶性分析取10 mL菌液超聲破碎后13 000×g離心10 min，分別取誘導(dǎo)后的標(biāo)簽蛋白質(zhì)、全菌蛋白質(zhì)、全菌超聲(40%功率；超聲2 s，暫停2 s；總時(shí)間10 min)后沉淀以及上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，驗(yàn)證目的蛋白質(zhì)大小以及表達(dá)形式。

1.2.6目的蛋白質(zhì)的純化按照GE蛋白純化試劑盒(HisTrap FF crude)純化包涵體形式蛋白質(zhì)的說明分別配制Binding Buffer(含20 mmol·L-1咪唑的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液)與含8 mol·L-1尿素的Binding Buffer，含8 mol·L-1尿素的Elution Buffer(含500 mmol·L-1咪唑的20 mmol·L-1磷酸鹽溶液)并分別調(diào)pH至7.4。用配制好的Binding Buffer將菌體沉淀重懸后進(jìn)行超聲裂解，裂解產(chǎn)物于4 ℃離心機(jī)13 000×g離心30 min后棄去上清。用含8 mol·L-1尿素的Binding Buffer將沉淀重懸后冰浴4 h至沉淀完全溶解，使用0.45 μm濾器對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行過濾，過濾液按照上述試劑盒說明書純化目的蛋白質(zhì)。

1.2.7表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定

1.2.7.1串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析：為了對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，將純化后的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后切下大小為57 ku的目的條帶，送至上海啟研生物科技有限公司進(jìn)行MS/MS鑒定，MS/MS數(shù)據(jù)采用默認(rèn)校準(zhǔn)。得到的數(shù)據(jù)通過軟件GPS(V3.6)采用MASCOT(V2.3)進(jìn)行檢索。搜索參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫(kù)為人蛋白質(zhì)庫(kù)、胰酶酶切，一個(gè)漏切位點(diǎn)，一級(jí)質(zhì)譜的容差為100 ppm，二級(jí)質(zhì)譜的容差為0.6 Da。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，蛋白質(zhì)得分大于56分被認(rèn)為膠內(nèi)蛋白質(zhì)與理論序列有可信的匹配(P<0.05)。

1.2.7.2Western blot鑒定：分別取誘導(dǎo)后的標(biāo)簽蛋白質(zhì)、純化后的目的蛋白質(zhì)、誘導(dǎo)后的重組菌超聲后裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，使用伯樂蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉(PBST配制)對(duì)PVDF膜進(jìn)行4 ℃過夜封閉，加入1∶100稀釋的牛副結(jié)核陽性血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗牛單克隆抗體，37 ℃孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min，按照Vector VIP試劑盒說明書配制顯色液后將PVDF膜顯色5 min。

1.2.8間接ELISA方法的建立

1.2.8.1使用棋盤法確定最佳抗原包被條件以及最佳血清稀釋度：將純化定量后的抗原按照200、100、50、25 ng·mL-1四個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜后PBST洗板三次；每孔加入100 μL含5%脫脂奶粉的PBST 4 ℃過夜封閉后使用。將陰陽性血清按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200四個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋后加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，37 ℃作用30 min，PBST洗板三次；每孔加入100 μL 1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG酶標(biāo)抗體，37 ℃作用30 min，洗板后每孔加入100 μL TMB顯色液室溫避光顯色15 min，每孔加入50 μL 1 mol·L-1HCl終止反應(yīng)，測(cè)定OD450 nm數(shù)值，以陽性血清與陰性血清的最適OD450 nm比值(P/N)所對(duì)應(yīng)的抗原包被濃度與血清稀釋度作為最佳濃度。

1.2.8.2最佳封閉條件的確立：確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋度后，分別使用含5%脫脂奶粉、5%馬血清、5%明膠的PBST溶液作為封閉液，進(jìn)一步優(yōu)化該ELISA方法，以背景值最低時(shí)的封閉液作為最佳封閉液。

1.2.8.3最佳酶標(biāo)抗體濃度的確立：按照優(yōu)化后的上述ELISA條件，將HRP標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)抗體分別進(jìn)行1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀釋后進(jìn)行ELISA反應(yīng)，選擇P/N值最大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度作為最適工作濃度。

1.2.8.5特異性試驗(yàn)：按照優(yōu)化后的ELISA方法，取實(shí)驗(yàn)室保存的牛副結(jié)核陽性血清、牛結(jié)核陽性血清、牛布病陽性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大腸桿菌陽性血清、牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.8.6敏感性試驗(yàn)：將陽性對(duì)照血清進(jìn)行2倍梯度稀釋，使用建立的ELISA方法對(duì)稀釋后陽性對(duì)照血清進(jìn)行檢測(cè)，確定陽性對(duì)照血清的最高稀釋度。

1.2.8.7符合性試驗(yàn)：按照建立的ELISA方法對(duì)200份山東省奶牛中心提供的牛血清、100份本實(shí)驗(yàn)室保存的牛血清進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與IDEXX副結(jié)核ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算二者符合率。

2結(jié)果

2.1質(zhì)粒鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳可見有兩條符合預(yù)期大小的條帶(圖1)，質(zhì)粒送公司測(cè)序后將結(jié)果與NCBI上提供的MAP0862序列進(jìn)行比對(duì)，符合率為100%，表明成功構(gòu)建了MAP0862重組質(zhì)粒，標(biāo)注為pET-MAP0862。

2.2重組蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、鑒定

分別取含有pET32a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌體裂解物、純化后的目的蛋白質(zhì)與經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，可見純化后的目的蛋白質(zhì)與重組菌裂解物均在約57ku處出現(xiàn)目的大小條帶(圖2)。將目的條帶切下經(jīng)過質(zhì)譜分析后，將質(zhì)譜得到的數(shù)據(jù)提交到數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，采用MASCOT算法進(jìn)行打分，蛋白質(zhì)最高得分為275，超過得分閾值，表示膠內(nèi)蛋白質(zhì)鑒定成功。經(jīng)過檢索，條帶內(nèi)的蛋白質(zhì)為副結(jié)核特異性蛋白MAP0862 (圖3) 。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后的重組質(zhì)粒M.DNA molecular weight marker；1，2.Identification of recombinant plasmid by restriction digestion圖1　重組表達(dá)質(zhì)粒pET-MAP0862酶切鑒定Fig.1　Restriction enzyme analysis for the recombinant plasmid pET-MAP0862

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：含pET32a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌體裂解物；2.純化后的MAP0862蛋白；3.含pET-MAP0862質(zhì)粒重組菌超聲裂解物M.Protein molecular weight marker；1.Bacteria cracking content of E.coil BL21 with pET-32a；2.Purified recombinant MAP0862；3.Bacteria cracking content of E.coil BL21 with pET-MAP0862圖2　重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis for the recombinant pET-MAP0862

圖3　重組蛋白質(zhì)MAP0862的MS/MS鑒定Fig.3　The tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis of MAP0862

2.3Western blot 鑒定

純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果在預(yù)期的57 ku處出現(xiàn)雜交條帶(圖4)。

2.4ELISA方法的建立

2.4.1優(yōu)化后的ELISA條件采用方陣試驗(yàn)確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋度，分別對(duì)三種不同的封閉液對(duì)該ELISA方法的背景值影響進(jìn)行比較，對(duì)酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度進(jìn)行確立，同時(shí)在此基礎(chǔ)上對(duì)該ELISA的其他條件進(jìn)行確立，各優(yōu)化后的結(jié)果見表1。

2.4.2陰陽性血清臨界值的確立取實(shí)驗(yàn)室保存的58份牛副結(jié)核陰性血清使用該ELISA方法測(cè)定OD450 nm數(shù)值，經(jīng)計(jì)算平均值與s分別為0.224與0.055，即ELISA方法的臨界值確定為0.389，當(dāng)樣品OD450 nm數(shù)值大于0.389時(shí)判定為陽性，小于0.389時(shí)判定為陰性。

2.4.3特異性試驗(yàn)結(jié)果采用該ELISA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的不同血清檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，牛結(jié)核陽性血清、布病陽性牛血清、卡介苗免疫牛、牛大腸桿菌感染陽性血清的OD450 nm數(shù)值均小于臨界值，牛副結(jié)核陽性血清均檢測(cè)為陽性，表明該ELISA方法包被的MAP0862蛋白與其他血清均無明顯交叉反應(yīng)，該方法有較好的特異性。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.含pET32a(+)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21菌體裂解物；2.純化后的重組蛋白質(zhì)M.Protein molecular weight marker；1.Bacteria cracking content of E.coil BL21 with pET32a(+)；2.Purified recombinant MAP0862圖4　重組蛋白質(zhì)MAP0862的Western blot分析Fig.4　Western blot analysis of the expressed protein of MAP0862

表1間接ELISA方法的優(yōu)化結(jié)果

Table 1The optimized conditions of the indirect ELISA

重組蛋白質(zhì)包被條件Coatingwithrecombinantprotein封閉條件Blockingcondition待檢血清Sample酶標(biāo)抗體Enzyme-labelledantibody最佳稀釋條件Optimizeddilutionconditon25ng·mL-15%明膠的PBST溶液1∶1001∶10000作用條件Reactioncondition4℃過夜4℃過夜37℃30min37℃30min

2.4.4敏感性試驗(yàn)用建立的ELISA方法對(duì)2倍梯度稀釋的陽性對(duì)照血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽性血清稀釋32倍后使用優(yōu)化后的ELISA方法仍能判定為陽性(OD450 nm數(shù)值大于臨界值0.389)，即陽性血清稀釋3 200倍后仍能判定為陽性(圖5)。

2.4.5符合性試驗(yàn)使用該ELISA方法對(duì)于300份牛血清進(jìn)行檢測(cè)(結(jié)果見表2)，經(jīng)計(jì)算二者總符合率為94.3%，陽性符合率為64.5%，陰性符合率為97.7%。

3討論

副結(jié)核分枝桿菌(MAP)是主要引起反芻動(dòng)物副結(jié)核病的病原體，除了感染反芻動(dòng)物之外，MAP也能感染包括鳥類、兔、狐貍、獾等在內(nèi)的一些野生動(dòng)物[6]，目前該病在全世界流行，給畜牧業(yè)帶來了巨大損失[7]。副結(jié)核流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)奶牛副結(jié)核病陽性率與牛場(chǎng)管理水平相關(guān)，比較高的牛場(chǎng)基本能達(dá)到15%左右[8]，與本試驗(yàn)室調(diào)查結(jié)果基本一致。汪天杰等最近對(duì)從澳大利亞出口到我國(guó)的6 810頭種羊進(jìn)行副結(jié)核檢測(cè)，結(jié)果陽性率為1.53%[9]，提示即便是動(dòng)物疫病控制得比較好的國(guó)家，副結(jié)核病發(fā)生也是比較普遍的。

圖5　敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5　Result of sensitivity test

表2MAP0862間接ELISA方法與IDEXX牛副結(jié)核檢測(cè)試劑盒符合率

Table 2The coincidence rate of MAP0862 i-ELISA and IDEXX MAP ELISA kit

IDEXX牛副結(jié)核檢測(cè)試劑盒IDEXXMAPELISAkitPN合計(jì)TotalP201131間接ELISAi-ELISAN6263269合計(jì)Total26274300

副結(jié)核病的診斷方法除了經(jīng)典的皮膚變態(tài)反應(yīng)外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)菌分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等[10]。副結(jié)核的分離培養(yǎng)比較困難，需要在培養(yǎng)基中添加提取的草分枝桿菌素作為輔助培養(yǎng)物[11]，但即便如此，初代分離副結(jié)核也相當(dāng)困難需要較長(zhǎng)的周期。目前使用的基于核酸檢測(cè)的PCR或熒光定量PCR方法[12]對(duì)副結(jié)核病原的診斷由于操作復(fù)雜很難在生產(chǎn)中得到普及同時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。1978年首次采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來診斷牛副結(jié)核病[13]，該方法是目前檢測(cè)副結(jié)核病抗體的最簡(jiǎn)便方法，其操作方法簡(jiǎn)單適合在生產(chǎn)中普及。目前已有商品化的進(jìn)口副結(jié)核ELISA檢測(cè)試劑盒，但是價(jià)格較高，很難在生產(chǎn)中得到大規(guī)模應(yīng)用。

本研究中，選取副結(jié)核特異性蛋白質(zhì)MAP0862進(jìn)行原核表達(dá)并進(jìn)一步純化定量后作為ELISA包被抗原。重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式表達(dá)，通過對(duì)包涵體復(fù)性、純化獲得了具有生物活性的重組蛋白質(zhì)。Western blot鑒定結(jié)果表明，牛副結(jié)核陽性血清與MAP0862重組蛋白在57 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，表明MAP0862蛋白具有良好的反應(yīng)原性。Western blot結(jié)果中仍可見微弱的非特異性雜交帶，原因可能是純化蛋白質(zhì)中仍摻雜有微量宿主菌蛋白質(zhì)，與血清中含的大腸桿菌抗體反應(yīng)所致。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，副結(jié)核陰性對(duì)照血清與牛大腸桿菌感染陽性血清也顯示了較高的背景值(OD450 nm約0.2)，這可能是由于檢測(cè)牛血清中存在對(duì)His標(biāo)簽的非特異性吸附的抗體，另一方面純化蛋白質(zhì)中仍有少量宿主菌(E.coliBL21)蛋白質(zhì)的殘留。

本研究中使用的牛副結(jié)核陽性對(duì)照血清來源于人工感染副結(jié)核牛，對(duì)感染牛進(jìn)行的皮膚變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)、γ-IFN釋放試驗(yàn)以及使用IDEXX副結(jié)核ELISA試劑盒對(duì)血清進(jìn)行的抗體檢測(cè)同時(shí)判定為副結(jié)核陽性；特異性試驗(yàn)中使用的牛副結(jié)核陽性血清來自臨床分離，對(duì)感染牛進(jìn)行的γ-IFN釋放試驗(yàn)以及使用IDEXX副結(jié)核ELISA試劑盒對(duì)血清的檢測(cè)均判定為副結(jié)核陽性；牛布病陽性血清經(jīng)試管凝集試驗(yàn)與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)均判定為陽性；牛結(jié)核陽性血清和卡介苗免疫牛血清為本實(shí)驗(yàn)室人工感染動(dòng)物制備，并經(jīng)皮試試驗(yàn)和IFN-γ釋放試驗(yàn)驗(yàn)證；牛大腸桿菌陽性血清來自臨床分離鑒定并由本實(shí)驗(yàn)室保存。用初步建立的MAP0862間接ELISA方法對(duì)上述已知背景的樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法具有較好的特異性，能有效地區(qū)分牛副結(jié)核陽性血清與其他干擾血清。對(duì)300份臨床血清的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)外進(jìn)口試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較表明二者的總符合率為94.3%，試驗(yàn)結(jié)果中存在著陽性符合率低的缺點(diǎn)，分析可能原因一是其中陽性樣本較少導(dǎo)致陽性符合率較低，后期需要進(jìn)一步增加副結(jié)核陽性樣本以對(duì)該方法進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。二是牛感染副結(jié)核后不同時(shí)期MAP0862蛋白表達(dá)量不同，導(dǎo)致牛血清中針對(duì)該蛋白質(zhì)的特異性抗體含量不同，對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)量較低時(shí)期應(yīng)用該方法可能不能有效的檢測(cè)出抗體存在。目前已有的副結(jié)核檢測(cè)方法，并沒有一種方法能將感染副結(jié)核后不同時(shí)期的血清都判定為陽性。針對(duì)副結(jié)核的檢測(cè)需要聯(lián)合使用多種檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)于可疑牛場(chǎng)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)以確定牛場(chǎng)是否存在副結(jié)核感染。

4結(jié)論

通過原核表達(dá)獲得副結(jié)核特異性蛋白MAP0862，純化并定量后作為包被抗原，經(jīng)過一系列條件優(yōu)化后初步建立了針對(duì)副結(jié)核的間接ELISA方法。該方法能有效地鑒別副結(jié)核陽性血清以及其他干擾血清，使用該方法對(duì)臨床血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明該方法與IDEXX副結(jié)核檢測(cè)試劑盒的符合率為94.3%?；诟苯Y(jié)核特異性蛋白MAP0862建立的間接ELISA診斷方法能有效檢測(cè)牛副結(jié)核病。

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(編輯白永平)

Expression of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis MAP0862 and Its Primary Application in Indirect ELISA

ZHANG Zhen1，2，F(xiàn)ENG Yu1，ZHANG Ge2，ZHU Liang-quan2，JIANG Hui2，DING Jia-bo2*，ZHAO Peng1，CHANG Wei-shan1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

Abstract:The objective of the present study was to explore the effect of MAP0862 in sero-diagnosis of Bovine paratuberculosis，and establish a specific ELISA method based on MAP0862.The specific protein obtained by prokaryotic expression was used as coating antigen after purification and quantification，an indirect ELISA was primary established after a series of optimization.The specificity of this method was verified by MAP antiserum，Brucellaantiserum，Bovine tuberculosis (TB) antiserum，BCG antiserum，Escherichiacoliantiserum and negative serum.The detection results of 300 serums showed that the coincidence rate of MAP0862 indiret ELISA with commercial kit was 94.3%.The result indicated that the indirect ELISA method primary established based on MAP0862 can detect Bovine paratuberculosis effectively.

Key words:Bovine paratuberculosis；MAP0862；ELISA

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.019

收稿日期：2015-07-27

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃；北京市科技新星(xx2013099)

作者簡(jiǎn)介：張振(1990-)，男，山東濟(jì)南人，碩士生，主要從事重要人畜共患病診斷技術(shù)和新型疫苗研究，E-mail:sdauzz@163.com *通信作者：常維山，E-mail:wschang@sdau.edu.cn；丁家波，E-mail:dingjiabo@126.com

中圖分類號(hào)：S855.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)04-0789-07