申 遠，蔡正浩，王 川，弓曉杰

（1.大連大學 人才建設辦公室，遼寧 大連 116622；2.大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；3.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

葡萄糖分子印跡電極測定唾液中葡萄糖

申 遠1，蔡正浩2，王 川2，弓曉杰3

（1.大連大學 人才建設辦公室，遼寧 大連 116622；2.大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；3.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

采用分子印跡技術、鄰苯二胺為功能單體，通過循環(huán)伏安法對該電極進行性能考察。結果表明，該分子印跡電極對葡萄糖具有較好的靈敏度與選擇性，線性范圍為1×10-9~1×10-8mol/L，檢出限(S/N=3)為1×10-9mol/L。將電極用于實際樣品的分析，方法回收率為96.3%~100.9%，RSD為0.15%~4.4%。測定了多個口腔唾液樣本中葡萄糖的含量，檢測結果均在8.37~12.68 mg/L范圍內(nèi)。由此認為，該電極可以直接用于檢測人體口腔唾液葡萄糖含量，實現(xiàn)對人體中血糖水平無創(chuàng)性檢測。

唾液；葡萄糖；分子印跡；循環(huán)伏安法

分子印跡技術源于超分子化學，是利用特定的模板分子為印跡分子，制備對目標分子具有特殊印跡識別功能的聚合物[1]。葡萄糖（Glu）是生物體中新陳代謝不可缺少的能量物質，其在生物體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應時所放出的熱量是生物體生命活動的直接能量來源[2]。糖尿病這種“不治之癥”給人類健康和生活帶來了極大的影響[3]。唾液葡萄糖含量被證明與人體血糖指標存在有相關性，有研究表明正常人體唾液葡萄糖為4~12.5 mg/L[4]。目前葡萄糖的檢測方法有碘量法，化學發(fā)光法，高效液相色譜法，酶電極法等[5-7]。近年來，基于化學修飾電極的電化分析方法在醫(yī)學領域、生物分析、藥物分析領域發(fā)展迅速。但是，修飾電極膜的穩(wěn)定性和選擇性等性能亟待提高[8]。分子印跡膜因為具有高的穩(wěn)定性和特異性識別功能，可以彌補電化學修飾電極在電化學分析中特異性不足的問題[9,10]。

本工作使用的功能單體是鄰苯二胺(POPD)，模板分子是葡萄糖(Glu)，甲基丙烯酸(Methyl acrylic acid)為交聯(lián)劑，在玻碳電極表面電聚合成聚鄰苯二胺(POPD)膜，在超聲條件下洗脫Glu模板分子并對實驗條件進行優(yōu)化，制備具有良好選擇性的葡萄糖分子印跡電極。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學工作站CS300型(武漢科思特公司)；玻碳電極(GCE，φ=3 mm)，飽和Ag/AgCl電極(天津艾達恒晟公司)，對電極為鉑絲電極；QT-2060型數(shù)控超聲波清洗器(天津瑞普公司)；普希科P4－036型筆式酸度計(樂清大倉電子公司)。

葡萄糖(天津市凱信化學工業(yè)有限公司分析純AR），鄰苯二胺（Aladdin，AR 98%)，甲基丙烯酸(國藥集團化學試劑有限公司化學純CP)，自制0.1 mol/L pH=7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉（PBS）緩沖溶液，二次蒸餾去離子水作為實驗用水。

1.2 玻碳電極的活化

將GCE在麂皮上先使用1.0 um的Al2O3粉末拋光后在使用0.3 um的Al2O3粉末二次拋光至鏡面光滑，依次用二次蒸餾水、0.1 mol/L H2SO4掃描至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定、無水乙醇和二次蒸餾水在超聲清洗器中清洗5 min。將清洗后的電極置于K3［Fe(CN)6］(5 mmol/L)探針分子溶液中循環(huán)伏安掃描，直到獲得合適的循環(huán)伏安（CV）曲線。將活化好的電極保存存在二次蒸餾去離子水以備下次使用。

1.3 分子印跡電極的制備

將活化好的GCE置于含由0.1 mol/L pH=7.0PBS緩沖溶液新制的含有1.0 mmol/L OPD與10 mmol/L Glu溶液中，采用循環(huán)伏安法(設置電位范圍為-1～1 V，掃速為100 mV/s)，循環(huán)掃描15圈，即在潔凈的GCE表面聚合形成一層POPD膜。將聚合后的電極(Glu/POPD/GCE)放入體積分數(shù)比為6:4的甲醇/乙酸混合洗脫液中，在超聲清洗器中超聲8 min洗脫Glu模板分子，得到Glu的分子印跡電極(Glu/MIP/GCE)。

1.4 試驗方法

三電極系統(tǒng)裝置為：工作電極(MIP/GCE)，參比電極(飽和Ag/AgCl電極)，對電極(鉑絲電極)。將MIP/GCE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6］探針分子溶液中，采用循環(huán)伏安(CV)法，掃速為100 mV/s。

2 結果與討論

2.1 分子印跡敏感膜的制備與性質

聚合過程的CV曲線如圖1所示。由圖可見OPD的電聚合是一個不可逆過程。隨著掃描圈數(shù)的增加、在GCE表面的POPD聚合膜的厚度也隨之增加，檢測到的峰電流卻隨之降低。這表明POPD聚合膜是一層不導電的絕緣膜。

圖1 OPD電聚合過程的CV曲線

如圖2所示，探針分子在Glu/POPD/GCE修飾電極表面響應的峰電流明顯降低（曲線3），這可能是由于Glu分子中的多個羥基與OPD中的氨基可以相互作用而形成氫鍵，因此在OPD的電化學聚合過程中，Glu分子被鑲嵌到POPD膜中。由于分子印跡膜是一層不導電的絕緣膜，探針分子無法穿過分子印跡膜到達GCE表面進行傳質而導致峰電流較低。用體積比為甲醇：乙酸=6:4的溶液在超聲清洗器中超聲8 min洗脫模板Glu分子后，探針分子在MIP/GCE修飾電極表面檢測到的峰電流明顯提高（見曲線2）。這表明分子印跡膜上出現(xiàn)了空洞，為探針分子的電子傳遞提供了通道；由于分子印跡膜的存在，阻礙了探針分子的傳質過程，因此裸露的GCE電極上檢測到的峰電流值為最大（如曲線1所示）。

圖2 不同電極在K3[Fe(CN)6]中的CV曲線

2.2 電極性能的比較

采用CV法對MIP/GCE與GCE的電化學性能做了對比。如圖3所示，裸露的玻碳電極GCE（曲線2），在PBS緩沖體系為溶劑的Glu溶液中無電化學響應，而分子印跡電極MIP/GCE在-0.5和-0.3V附近出現(xiàn)了一對氧化還原峰（見曲線1）。這表明Glu溶液在該分子印跡電極表面具有良好的電化學響應性能。這可能是由于分子印跡膜上的模板Glu分子被洗脫后再POPD表面留下的空洞在空間結構上與Glu分子形成互補，并且具有特異性的氫鍵識別位點。當MIP/GCE放入Glu溶液中時，印跡膜上的空洞與Glu分子匹配性結合而實現(xiàn)印跡識別，進而對 Glu在該電極（MIP/GCE）表面的氧化還原反應產(chǎn)生一定的電化學催化作用、所以峰電流明顯提高。

圖3 不同電極在Glu溶液中的響應曲線

2.3 電聚合過程條件的影響

2.3.1 聚合圈數(shù)的選擇

研究了在玻碳電極表面修飾圈數(shù)對分子印跡膜性能的影響。如圖4所示，在聚合15圈時所制備的分子印跡電極對探針分子的電化學響應為最好。

圖4 聚合層數(shù)的選擇

2.3.2 單體分子與模板分子用量比選擇

單體分子與模板分子用量比較小時，單體與模板分子難以充分聚合，而單體用量過多時又會對模板分子產(chǎn)生包埋、不利于洗脫Glu模板分子，并導致峰電流和靈敏度降低?？疾炝薕PD與Glu摩爾濃度之比分別為1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1條件下的峰電流。結果如圖5所示，當用單體與模板分子的摩爾比為1∶1時，峰電流值最大。

圖5 模版分子與單體分子比例的選擇

2.3.3 緩沖溶液pH選擇

緩沖體系的酸堿度對分子印跡膜的性能會產(chǎn)生一定的影響。在酸性條件下POPD易聚合而成，但酸性過大會使膜的穩(wěn)定性降低會使印跡膜發(fā)生分解。采用循環(huán)伏安技術、用氰化鉀探針探究了不同pH值的緩沖體系對分子印跡膜性能的影響，如圖6所示，該緩沖體系的最佳pH值為7.0。

圖6 聚合液pH的選擇

2.3.4 洗脫條件的選擇

如圖7所示，K3［Fe(CN)6］響應的峰電流隨洗脫時間的增加而提高，當洗脫時間超過8 min時峰電流降低，可能是由于Glu模板分子在8 min前未被完全洗脫，在9 min時分子印跡膜被破壞導致分子印跡膜的性能降低。因此選擇最佳的洗脫時間為8 min。

圖7 洗脫時間的選擇

探究了洗脫液比例對洗脫效果和分子印跡膜性能的影響。如圖8所示，當洗脫液組成為甲醇/乙酸=6:4時，洗脫效果最好、Glu溶液在該分子印跡電極表面的峰電流值最大、電化學響應最好。

圖8 洗脫液比例的選擇

3 分子印跡電極的性能測試

運用CV法測定了該分子印跡電極在不同標準濃度葡萄糖溶液中的電化學響應情況。如圖9中MIP/GCE對不同濃度Glu溶液的峰電流變化曲線所示，當濃度在1×10-9~1×10-8mol/L范圍內(nèi)峰電流呈現(xiàn)良好的線性關系，回歸方程為Ip（uA）=325.88c（umol/L）+12.352，及Ip（uA）=-315.17c（umol/L）-24.148，線性相關系數(shù)分別為0.9691和0.9543，相比之下氧化峰的線性更佳，所以選擇氧化峰的回歸方程作為工作曲線。其檢出限（S/N=3）為1×10-6mol/L，用該印跡電極對2×10-6mol/L的Glu溶液進行了10次測定，RSD值為0.6151%，表明該印跡電極的重現(xiàn)性良好。

圖9 MIP/GCE對不同濃度的Glu的CV響應曲線與線性方程

4 樣本分析

人體空腹口腔唾液樣本葡萄糖的測定。取正常人體早晨8時空腹唾液樣品，在干凈的離心管中經(jīng)離心獲取上層清夜，用微量進樣器取1 uL口腔唾液樣本用pH=7.0 PBS稀釋定容至10 mL，全部轉移至小燒杯中，在前述測試條件下測定其Glu含量并進行回收率實驗，結果如表1所示。

表1 回收率實驗結果（n=5）

5 結論

以鄰苯二胺為功能單體、以體積比為6:4的甲醇/乙酸混合液為模板洗脫液，制備了葡萄糖分子印跡敏感膜電極。該分子印跡電極對葡萄糖具有較好的靈敏度與選擇性，線性范圍為1×10-9~1×10-8mol/L，氧化峰線性相關系數(shù)為0.9691。將電極用于實際樣品的分析，其方法回收率為96.3%~100.9%，RSD為0.15%~4.4%。測定的多個口腔唾液樣本中的葡萄糖含量為8.37~12.68 mg/L。為此，可以認為該電極能用于直接檢測人體口腔唾液中的葡萄糖含量，從而為實現(xiàn)人體無創(chuàng)性血糖檢測提供依據(jù)。

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Glucose Molecularly Imprinted Electrode Detects Glucose in Saliva

SHEN Yuan1,CAI Zheng-hao2,WANG Chuan2,GONG Xiao-jie3
（1.Talents Construction Office of Dalian University,Dalian 116622,China,2.College of Environment and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian 116622,China;3.College of Medicine,Dalian University,Dalian 116622,China）

Molecularly imprinted membrane(OPOD)was prepared by molecular imprinting technique to synthesize poly(o)-benzene two amine molecules on the surface of glassy carbon electrode(GCE)by using the two amines as functional monomers.K3［Fe(CN)6］was used as probe molecule,and the electrode was investigated by cyclic voltammetry.The results showed that the imprinted electrode for Glu with good sensitivity and selectivity,the linear range for 1× 10-9~1× 10-8mol/L,the detection limit(S/N=3)was 1×10-9mol/L,the electrode has good reproducibility and stability.The electrode was used for the analysis of the actual saliva samples.The recovery rate was between 96.3%and 100.9%.Determination of the content of a plurality of different normal human oral salivary Glu detection,and the result is great,all fall within the normal range of detection that the electrode can be used for direct detection of saliva Glu detection,realize of non-invasive detection whether excessive blood sugar.

saliva;Glu;molecularly imprinted;electropolymerization;cyclic voltammograms

O657.15

：A

：1008-2395(2016)06-0054-05

2016-10-08

遼寧省科學技術計劃項目（2013204001）。

申遠(1982-)，男，助理研究員，研究方向：電分析化學。