王凱玲, 任 濤

(同濟大學附屬東方醫(yī)院呼吸科，上海 200123)

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NSCLC患者血漿游離DNA檢測的臨床意義

王凱玲, 任 濤

(同濟大學附屬東方醫(yī)院呼吸科，上海 200123)

目的 評估血漿游離DNA含量在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)診療中的應(yīng)用價值。方法 收集61例非小細胞肺癌患者和18例健康人的血漿，提取血漿游離DNA，熒光定量PCR方法檢測DNA濃度。結(jié)果 健康人血漿游離DNA水平中位數(shù)為73.70(53.49～85.03)ng/ml，非小細胞肺癌患者血漿游離DNA水平為179.43(160.94～401.34)ng/ml，兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。血漿游離DNA含量與非小細胞肺癌患者的性別、年齡、吸煙狀況及病理類型均無明顯相關(guān)性，與有無轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.01)。結(jié)論 非小細胞肺癌患者的血漿游離DNA是一種潛在有價值的生物學標志物，可作為臨床上診斷肺癌、預(yù)測疾病進展、快速評估治療療效的工具。

非小細胞肺腫瘤； 游離DNA； 液體活檢

血液中循環(huán)的DNA，稱為游離DNA(cell-free DNA， cfDNA)。檢測腫瘤患者血漿或血清中的cfDNA，猶如做“液體活檢”，不僅可以通過檢測遺傳學和表觀遺傳學的改變?yōu)樵\斷提供幫助，而且可以了解腫瘤負荷、評價治療效果。因此，cfDNA被認為是很有潛力的腫瘤標記物。本研究以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者為研究對象，通過分析非小細胞肺癌患者血漿中游離DNA水平，為游離DNA在肺癌診治中的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2015年5月至2016年1月同濟大學附屬東方醫(yī)院呼吸科和胸外科就診的NSCLC患者61例，年齡41～83歲，中位年齡61歲；所有患者均有細胞病理學證據(jù)確診。其中，Ⅰ期12例、Ⅱ期8例、Ⅲ期8例、Ⅳ期33例；鱗癌15例、腺癌46例；PS評分在0～3分；采血前均未接受手術(shù)、放療及化療等抗腫瘤治療。同時收集健康人18例作為對照組，年齡36～64歲，中位年齡44.5歲，其性別、吸煙情況構(gòu)成比與入組NSCLC患者相應(yīng)構(gòu)成比匹配。所有研究對象均排除肝炎、糖尿病、慢性炎癥及免疫系統(tǒng)疾病，均知情同意。

1.2 血漿標本采集

分別抽取檢測對象前臂靜脈血5ml，放入EDTA抗凝管中，室溫放置2h后20℃，離心半徑15cm，4000r/min，離心5min，取上層血漿放入凍存管，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血漿DNA提取

血漿游離DNA用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(德國，Qiagen公司)提取。取待提取血漿樣本600μl，分別調(diào)整蛋白酶、Buffer AL、乙醇(100%)劑量至60μl、600μl、600μl，最后加入 40μl的Buffer AE洗脫液。其余均嚴格按照說明書所述的方法。提取的血漿游離DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血漿游離DNA濃度的檢測

用二甲基亞砜(DMSO)凋亡A549細胞株，24h后取上清液，PI染色后行流式細胞儀檢測，檢測細胞凋亡、壞死水平。取上清液，用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒按上述方法提取游離DNA。紫外分光光度法測定提取的游離DNA濃度，梯度稀釋獲得DNA標準品。

血漿游離DNA濃度的檢測應(yīng)用LINE1，引物序列如下。上游引物： 5′-ACTTGGAACCAACCC-AAATG-3′；下游引物： 5′-CACCACAGTCCCCA-GAGTG-3′；擴增產(chǎn)物長度266bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

將DNA標準品和提取的血漿游離DNA進行實時熒光定量PCR擴增。實時熒光定量PCR使用SYBR(TaKaRa公司)試劑盒，PCR總反應(yīng)體系為20μl，包括SYBR?Premix Ex TaqTMII 10μl，F(xiàn)orward Primer 0.8μl，Reverse Primer 0.8μl，ROX Reference Dye II 0.4μl，DNA模板2μl，ddH2O 6μl。循環(huán)參數(shù)： 95℃預(yù)變性30s；95℃ 5s，60℃ 30s，共40個循環(huán)。

用已知濃度的DNA標準品得到的ct值繪制標準曲線。ct值與DNA含量的對數(shù)存在線性關(guān)系，用實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件根據(jù)樣品中的ct值得到樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)。對實驗數(shù)據(jù)進行分析，提示數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故結(jié)果采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。兩組樣本間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功制備標準品

DMSO可誘導(dǎo)人肺癌細胞凋亡。將20%的DMSO加入A549細胞培養(yǎng)液中，24h后可使細胞凋亡和壞死達到90%以上，見圖1。用QIAGEN試劑盒提取上清液中的游離DNA，以此cfDNA作為檢測血漿游離DNA濃度的標準品原型。紫外分光光度法測定提取的游離DNA濃度為5.7×104ng/ml，梯度稀釋獲得濃度為5.7×103、5.7×102、5.7×101、5.7ng/ml的DNA標準品。

2.2 標準曲線的建立

成功構(gòu)建標準品的擴增曲線，建立標準曲線(圖2)，ct值與模板起始濃度對數(shù)值之間具有較好的線性關(guān)系(R2=0.996)。目的基因熔解曲線無雜峰。

圖1 24h后A549細胞凋亡流式圖Fig.1 Flow diagram of apoptosis in A549 cells after 24h

圖2 以LINE1為引物的基因組DNA標準品熒光定量標準曲線Fig.2 Fluorescence quantitative standard curve of the standard by LINE1

2.3 肺癌組及健康對照組血漿游離DNA水平比較

非小細胞肺癌組和健康對照組血漿游離DNA含量分別為179.43(160.94～401.34)、73.70(53.49～85.03)ng/ml。目的基因含量在非小細胞肺癌組和健康對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 NSCLC患者血漿游離DNA含量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

血漿游離DNA含量與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙狀況及病理類型均無明顯相關(guān)性，與有無轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.01)，見表1。

表1 NSCLC患者血漿游離DNA含量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。2010年我國新發(fā)肺癌病例數(shù)高居惡性腫瘤榜首。盡管目前有影像學、腫瘤標記物等多種方法用于肺癌早期診斷，但仍存在敏感性不高、特異性不強、準確性差等缺點[1]。因此，希望能夠建立一種靈敏度高、特異性好的，準確、簡單、方便的檢測方法，能夠作為肺癌的一種生物標志物，用于診斷、預(yù)后評價和治療監(jiān)測。

Vasioukhin等[2]和Sorenson等[3]在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征和胰腺癌患者外周血中檢測出突變的RAS基因片段，cfDNA才被認為是有潛力的腫瘤標記物，檢測血漿或血清中的cfDNA猶如“液體活檢”。為了確保得到較高質(zhì)量的DNA定量，本研究采用SYBR進行實時熒光定量PCR檢測，可提供精確的、可重復(fù)性良好的擴增DNA定量。由于白細胞在體外凝血、纖溶導(dǎo)致血清cfDNA含量明顯高于血漿[4]，故本研究選擇肺癌患者血漿進行cfDNA檢測。由于腫瘤患者的cfDNA主要來源于細胞的凋亡、壞死，故誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡壞死后制成的標準品可能較以往直接從細胞中提取DNA作為檢測NSCLC患者血漿cfDNA的標準品，準確性更佳，此為本實驗的創(chuàng)新點。研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿cfDNA水平明顯高于健康人群(P<0.01)，該趨勢與Shapiro等[5]及Szpechcinski等[6]研究者的結(jié)果一致。其主要原因可能是在健康人血漿中，cfDNA來自于凋亡細胞；而腫瘤患者的細胞凋亡、壞死和分泌釋放大量的cfDNA。提示血漿cfDNA含量在NSCLC患者中具有較高的區(qū)分度，可能成為NSCLC早期診斷的指標。然而各研究之間NSCLC患者血漿cfDNA含量與健康對照組之間的倍數(shù)關(guān)系卻有區(qū)別。Lodovini等[7]證明76例肺癌患者血漿cfDNA水平[(60.0±99.8)ng/ml)]是66例對照組[(6.0±8.8)ng/ml)]的10倍；Sozzi等[8]報告84例NSCLC患者血漿cfDNA水平較43例健康對照組(分別為318ng/ml和18ng/ml)高17倍。該現(xiàn)象可能與cfDNA提取、定量的方法、標準品參考的多樣性有關(guān)，同時又反映了腫瘤-宿主生物相互作用的復(fù)雜性和多樣性。

本研究在cfDNA含量與臨床病理參數(shù)相關(guān)性中，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者與健康對照組的血漿cfDNA水平在年齡上差異無統(tǒng)計學意義。年齡對cfDNA的潛在影響在現(xiàn)有的文獻報道中并不一致。Jylh?v?等[9]的一項研究顯示，老年婦女(>90歲)相對年輕的對照組(22～37歲)有較高的血漿cfDNA水平(P<0.05)。由于該數(shù)據(jù)集樣本不大其可靠性仍不確定。Sozzi等[10]檢測100例非小細胞肺癌患者和相等數(shù)量健康人的cfDNA濃度，發(fā)現(xiàn)年齡與cfDNA含量存在正相關(guān)(P=0.001)。Yoon等[11]觀察到102例患者和105例對照組的血漿cfDNA濃度與年齡沒有顯著相關(guān)性。當要求的精度越高，可推斷性要求越高時，要求樣本量越大。因此，任何綜合分析需要在一個相匹配的、樣本量較大的群體中進行研究。

本研究證實血漿cfDNA含量與病理類型無明顯相關(guān)性。Paci等[12]和Szpechcinski等[13]也指出血漿cfDNA水平在組織學上無顯著差異，然而鄧水秋等[14]和張弦等[15]報道腺癌患者血清游離cfDNA水平明顯高于鱗癌患者。是否因為不同組織學類型的NSCLC存在基因組學或代謝組學上的差異，或是存在增殖動力學差異，有待進一步驗證。

本研究提示，Ⅳ期NSCLC患者血漿cfDNA水平明顯高于其他肺癌期患者，與有無轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.01)，與Madhavan等[16]研究結(jié)果相符。原因可能是Ⅳ期肺癌患者腫瘤負荷量較大，腫瘤細胞數(shù)量多，脫落、凋亡、壞死機會大。Diehl等[17]估計，一個重約100g的腫瘤，每天約有3×1010個細胞的DNA進入到血液循環(huán)中，循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞和轉(zhuǎn)移病灶也都能夠釋放cfDNA。提示血漿cfDNA水平過高可預(yù)示疾病的嚴重程度，說明腫瘤負荷高，可預(yù)測肺癌的進展。

綜上所述，血漿游離DNA水平與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是一種潛在的有價值的生物學標志物，其量化是臨床上診斷肺癌、預(yù)測疾病嚴重程度的工具。然而，血漿中的cfDNA含量是否能夠快速評估NCSLC患者的抗腫瘤治療效果，是否能夠?qū)︻A(yù)后進行預(yù)測，這些問題都需要今后進一步研究。

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Clinical significance of plasma cell free DNA detectionin in non-small cell lung cancer patients

WANGKai-ling，RENTao

(Dept. of Respiratory, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200123, China)

Objective To evaluate the dection of plasma cell free DNA content in the diagnosis and treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The plasma samples were collected from 61 cases of NSCLC patients and 18 healthy subjects. The plasma cell free DNA was extracted using GIAGEN reagent. The concentration of cell free DNA was detected by fluorescence quantitative PCR method. Results The level of plasma cell free DNA was 73.70 (53.49-85.03)ng/ml in control group and 179.43(160.94-401.34)ng/ml in NSCLC group(P<0.01). Plasma cell free DNA was not correlated with gender, age, smoking and pathological type of NSCLC patients, but correlated with cancer metastasis(P<0.01).Conclusion The dection of plasma cell free DNA can be used as a biological marker for diagnose and prognosis for NSCLC patients.

non-small cell lung cancer; cell free DNA

10.16118/j.1008-0392.2016.04.009

2016-03-14

國家自然科學基金(81372347)

王凱玲(1979—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail： wangkailinger@163.com

任 濤.E-mail： rentao305@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2016)04-0046-05