曹帆帆， 徐莉敏， 王 瑩， 彭 彬， 張 雪， 張登海

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院中法合作中心實驗室，上海 200135； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

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雷公藤紅素對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞Tau蛋白異常磷酸化影響的研究

曹帆帆1， 徐莉敏2， 王 瑩1， 彭 彬1， 張 雪1， 張登海1

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院中法合作中心實驗室，上海 200135； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

目的 觀察雷公藤紅素對β淀粉樣蛋白1-42導(dǎo)致SH-SY5Y細胞Tau蛋白異常磷酸化的影響及其可能機制。方法 用 Aβ1-42刺激SH-SY5Y細胞，建立Tau蛋白異常磷酸化的細胞模型。加入雷公藤紅素干預(yù)，Western印跡法檢測Aβ1-42導(dǎo)致Tau蛋白異常磷酸化的變化，同時檢測p-NF-B表達情況；siRNA法下調(diào)TLR4表達，Western印跡法檢測Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化的變化情況；同時觀察下調(diào)TLR4后，Aβ1-42刺激對p-NF-B表達的影響。結(jié)果 Aβ1-42刺激SH-SY5Y細胞，導(dǎo)致Tau蛋白Ser199/202、Ser396位點的磷酸化水平增加，而雷公藤紅素能降低這兩個位點磷酸化水平；Aβ1-42導(dǎo)致細胞p-NF-B表達增加，雷公藤紅素干預(yù)后p-NF-B表達下調(diào)，且NF-B抑制劑BAY11-7082同樣能降低Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化；下調(diào)TLR4表達，Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化及p-NF-B表達下降。結(jié)論 雷公藤紅素降低Aβ1-42導(dǎo)致的SH-SY5Y細胞Tau蛋白異常磷酸化可能與其抑制TLR4/NF-B通路活性有關(guān)。

雷公藤紅素； β淀粉樣蛋白； Tau蛋白； Toll樣受體4； p-NF-B

Tau蛋白主要功能是維持神經(jīng)元微管系統(tǒng)穩(wěn)定，Tau蛋白的功能受其磷酸化狀態(tài)影響。Tau蛋白有數(shù)十個可被磷酸化位點。正常成熟腦中Tau蛋白分子含2～3個磷酸基。Tau蛋白與微管蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，存在可被磷酸化的位點，這些位點(以及結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外若干個位點)被異常磷酸化后，Tau蛋白與微管蛋白的結(jié)合力下降，Tau蛋白解離，喪失維持微管穩(wěn)定的作用，神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞[1-2]。Tau蛋白異常磷酸化所引起的神經(jīng)元退行性病，包括阿爾茨海默癥等(Alzheimer’s disease, AD)[3]，抑制Tau蛋白異常磷酸化，是神經(jīng)元退行性病治療領(lǐng)域重要研究方向之一。

研究[4]發(fā)現(xiàn)，天然化合物雷公藤紅素能顯著抑制小鼠腦神經(jīng)元Tau蛋白異常磷酸化，但機制不明。雷公藤紅素為核轉(zhuǎn)錄因子-B(nuclear transcription factor-B, NF-B)活化抑制劑，能抑制Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)活性[5]。本研究用凝聚態(tài)Aβ1-42作用于SH-SY5Y細胞,建立Tau蛋白異常磷酸化的細胞模型,觀察雷公藤紅素抑制Tau蛋白磷酸化是否通過阻斷TLR4/NF-κB通路這一途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Cambrex公司。β淀粉樣蛋白多肽片段1-42(Aβ1-42)購自美國Sigma公司。雷公藤紅素(Cel)購自美國Sigma公司(C0869)，DMSO溶解，貯存濃度為100mmol/L，工作濃度為600nmol/L，用培養(yǎng)基臨時配制。Tau磷酸化抗體Ser199/Ser202抗體(44768G)、Ser396抗體(44750G)均購美國Invitrogen公司。p-NF-B抗體(8242)、GAPDH抗體(2118)均購自美國Cell Signaling公司。TLR4轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉瑪公司。NF-B抑制劑BAY11-7082、二喹啉甲酸(bicincho ninic， BCA)蛋白檢測試劑盒及化學(xué)發(fā)光底物(enhanced chemiluminescent， ECL)試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。辣根過氧化氫酶標記二抗購自美國eBioscience公司?；瘜W(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)購自英國Syngene公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM/F-12培養(yǎng)基，分別加入10%胎牛血清(Cambrex公司)，1%青霉素-鏈霉素，37℃，5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 Tau蛋白異常磷酸化細胞模型建立

Aβ1-42用DMSO溶解，濃度為20mg/ml，溶解后加入PBS，濃度為1mg/ml。37℃孵育3d，使其成為凝集態(tài)。取貼壁生長良好的SH-SY5Y細胞，按1×106/ml種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。待細胞長滿時，棄培養(yǎng)板中原有培養(yǎng)基，按所需濃度加入1ml Aβ1-42，繼續(xù)培養(yǎng)6h。

1.4 細胞的藥物處理

取貼壁生長良好的SH-SY5Y細胞，按1×106/ml種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。待細胞長滿時，棄培養(yǎng)板中原有培養(yǎng)基，每孔加入1ml含雷公藤紅素(終濃度為600nmol/L)或BAY11-7082(終濃度為20μmol/L)及Aβ1-42的完全培養(yǎng)基，對照組加入同濃度DMSO，處理6h。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染

siRNA-TLR4及相應(yīng)的control siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計合成；按Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明，將siRNA-TLR4或其相應(yīng)的control siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中。

1.6 Western 印跡法檢測Tau蛋白異常磷酸化

將處理好的細胞收集并用冷PBS洗1遍后，加入一定量蛋白裂解液裂解，提取蛋白，并按蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度測定。取一定量蛋白按體積比5∶1，加入5×蛋白上樣緩沖液于100℃煮3～5min。待樣品冷卻至室溫后，上樣至濃度為8%～10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳、轉(zhuǎn)膜。膜經(jīng)封閉液在室溫下封閉1.5h后，與針對Tau不同磷酸化位點的抗體在4℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)洗滌液洗3次，每次10min后，將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在常溫下孵育1.5h，再次洗滌3次后，按照ECL試劑盒說明書進行顯色，并用化學(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)對條帶進行獲取及分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計分析,每組實驗重復(fù)3次，用組間t檢驗對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Aβ1-42刺激對Tau蛋白磷酸化表達的影響

與對照組相比，用終濃度為20μmol/L凝聚態(tài)Aβ1-42處理細胞6h后，Tau蛋白pSer199/202、pSer396表達明顯增加(P<0.01)。終濃度為10μmol/L 的Aβ1-42處理細胞，Tau蛋白磷酸化位點表達無明顯變化，見圖1。

圖1 不同濃度Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞Tau蛋白磷酸化位點的表達Fig.1 Aβ 1-42 induced Tau hyperphosphorylation at different concentrations in SH-SY5Y cells對照組(con)為DMSO組。A： Western 印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；與對照組相比，**P<0.01

2.2 雷公藤紅素對Tau蛋白磷酸化表達的影響

Aβ1-42處理細胞后，Tau蛋白pSer199/202、pSer262表達均明顯增加，而同時加入雷公藤紅素(終濃度為600nmol/L)及Aβ1-42(終濃度為20μmol/L)時，pSer199/202表達明顯下降(P<0.01)、pSer396表達同樣下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

圖2 Aβ1-42刺激及用雷公藤紅素干預(yù)后，SH-SY5Y細胞Tau蛋白磷酸化位點的表達Fig.2 Effects of tripterine onAβ1-42 induced Tau hyper-phosphorylation in SH-SY5Y cellsA： Western 印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；與Aβ組比較，*P<0.05，**P<0.01

Aβ1-42處理細胞后，p-NF-B表達明顯增加(P<0.01)，而同時加入雷公藤紅素及Aβ1-42時，p-NF-B表達顯著下降(P<0.01)，見圖3。

圖3 Aβ1-42刺激及用雷公藤紅素干預(yù)后，SH-SY5Y細胞p-NF-B的表達Fig.3 Effects of Tripterine on Aβ1-42 induced p-NF-B increasing in SH-SY5Y cellsA： Western印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；與Aβ組比較，**P<0.01

Aβ1-42處理細胞后，Tau蛋白pSer199/202、pSer396表達均明顯增加，而加入BAY11-7082干預(yù)后，pSer199/202與pSer396表達均下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

2.5 下調(diào)TLR4蛋白表達對Tau蛋白磷酸化的影響

下調(diào)TLR4蛋白表達后，用Aβ1-42處理細胞，Tau蛋白pSer199/202及pSer396表達均明顯下降(P<0.05)，見圖5。

Aβ1-42處理細胞后，p-NF-B表達明顯上升(P<0.01)，而下調(diào)TLR4蛋白后，p-NF-B表達下調(diào)(P<0.05)，見圖6。

圖4 Aβ1-42刺激及用BAY11-7082干預(yù)對SH-SY5Y細胞Tau蛋白磷酸化位點的影響Fig.4 Effects of BAY11-7082 on Aβ1-42 induced Tau hyperphosphorylation in SH-SY5Y cellsA： Western印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；與Aβ組比較，*P<0.05

圖5 下調(diào)TLR4蛋白對Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞Tau蛋白各磷酸化位點的影響Fig.5 Effects of knocking down TLR4 on Aβ1-42 induced Tau hyperphosphorylation in SH-SY5Y cellsAβ組為用control siRNA后，加Aβ1-42處理。A： Western印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；與Aβ組比較，*P<0.05

圖6 下調(diào)TLR4蛋白對Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞p-NF-B的影響Fig.6 Effects of knocking down TLR4 on Aβ1-42 induced p-NF-B increasing in SH-SY5Y cells對照組(con)為加control siRNA后，用DMSO處理；Aβ組為用control siRNA后，加Aβ 1-42處理。A： Western印跡法檢測條帶圖；B： 統(tǒng)計圖；*P<0.05；**P<0.01

3 討 論

Tau蛋白異常磷酸化后，神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)被破壞，過度磷酸化的Tau蛋白自發(fā)聚集形成雙股螺旋絲(paired helical filaments， PHF-tau)，進一步發(fā)展為神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NT)[6]。Tau蛋白Ser199/202、Ser396位點的過度磷酸化在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用尤為重要?？扇苄訟β沉積后,聚集為AD腦中常見的淀粉樣斑塊,從而導(dǎo)致神經(jīng)細胞毒性損傷及神經(jīng)退行性變。Aβ在體內(nèi)外能誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化，從而破壞微管的穩(wěn)定性，損傷軸突轉(zhuǎn)運，引起神經(jīng)元死亡[7]。本研究用凝聚態(tài)Aβ1-42作用于SH-SY5Y細胞，建立Tau蛋白高度磷酸化模型。終濃度20μmol/L的Aβ1-42作用6h后，Tau蛋白磷酸化位點Ser199/202、Ser396表達均明顯增加。

雷公藤紅素是三萜類天然化合物，由我國科學(xué)家于20世紀30年代，首次從中藥雷公藤中提取到。研究[4]發(fā)現(xiàn)，肝臟切除手術(shù)導(dǎo)致小鼠腦神經(jīng)元Tau蛋白高度磷酸化，出現(xiàn)術(shù)后認知功能障礙，而雷公藤紅素能顯著抑制Tau磷酸化，改善術(shù)后認知功能。本研究結(jié)果表明，在Tau蛋白異常磷酸化的體外模型細胞中，雷公藤紅素處理后，pSer199/202與pSer396表達明顯下降。

TLR4是天然免疫系統(tǒng)識別病原微生物的主要受體，在AD、帕金森病(Parkinson disease，PD)和肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8]。目前研究表明，Aβ沉積誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致AD發(fā)病的主要機制之一[9]。TLR4/NF-B信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)與抗炎免疫機制緊密相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。NF-B位于TLR4下游，通過信號傳導(dǎo)，促使NF-B從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進入細胞核，最終導(dǎo)致炎癥因子大量釋放。本研究顯示，雷公藤紅素能抑制Aβ1-42導(dǎo)致的NF-B活化，且NF-B抑制劑BAY11-7082干預(yù)可明顯降低Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化，表明雷公藤紅素降低Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化可能與其抑制NF-B活化有關(guān)。Reed-Geaghan等[10]發(fā)現(xiàn)，Aβ活化NF-B通路需要TLR4參與。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4蛋白表達，NF-B活化同樣受到抑制，Tau蛋白pSer199/202及pSer396表達均明顯下降。Lee等[5]研究顯示，雷公藤紅素通過阻止LPS與TLR4/MD2復(fù)合體的結(jié)合，從而降低TLR4活性[5]。這表明雷公藤紅素可能通過降低TLR4活性，抑制TLR4/NF-B信號通路，從而降低Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化。

綜上所述，雷公藤紅素能明顯抑制Aβ1-42導(dǎo)致的Tau蛋白異常磷酸化，其機制可能與其抑制TLR4/NF-B信號通路有關(guān)。

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Effects of Tripterine on Tau hyperphosphorylation induced by β-amyloid peptides in cultured SH-SY5Y cells

CAOFan-fan1,XULi-min2,WANGYing1,PENGBin1,ZHANGXue1,ZHANGDeng-hai1

(1. Sino-French Cooperative Central Lab, Shanghai Gongli Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200135, China; 2. Clinical laboratory, Shanghai Gongli Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200135, China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of tripterine on Tau hyperphospho-rylation induced by β-amyloid in SH-SY5Y cells. Methods The effects of tripterine on the changes of Tau hyperphosphorylation and p-NF-B induced by β-amyloid in SH-SY5Y cells were measured by Western blotting after TLR4 knocking down by siRNA. Results Compared with the control group, the expressions of Tau pSer199/202 and pSer396 were markedly increased after the induction of Aβ1-42, while the hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 induced by Aβ1-42was decreased by tripterine. The increasing of p-NF-B expression induced by Aβ1-42was decreased after the treatment of tripterine, and NF-B inhibitor BAY11-7082 also decreased the hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 induced by Aβ1-42.The hyperphosphorylation of Tau pSer199/202 and pSer396 and p-NF-B expression induced by Aβ1-42was decreased after knocking-down TLR4. Conclusion Decreasing of Tau hyperphosphorylation by Tripterine is partially via inhibiting the TLR4/NF-B signaling pathway．

tripterine; β-amyloid; Tau; Toll like receptor 4; p-NF-B

10.16118/j.1008-0392.2016.04.007

2016-04-18

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計劃(PWRq2013-11)；上海市青年科技英才揚帆計劃(15YF1410800)

曹帆帆(1983—)，女，主管技師，碩士.E-mail： yffs.c@163.com

張登海.E-mail： shanghai_zhang@hotmail.com

R 741

A

1008-0392(2016)04-0036-04