房星星, 路臻豪, 湯建平， 馮 潤, 楊邵英， 龔邦東

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200065)

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MSCs通過促分泌TGF-β1、IL-6和IL-10抑制干燥綜合征患者CD4+T細胞的活化增殖

房星星, 路臻豪, 湯建平， 馮 潤, 楊邵英， 龔邦東

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200065)

目的 體外探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)對原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome， pSS)患者外周血活化CD4+T細胞的免疫抑制效應(yīng)，分析MSCs促分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)、IL-6及IL-10在免疫抑制效應(yīng)中的作用。方法 原代分離臍帶MSCs，并經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定。分選成年健康者和pSS患者外周血CD4+T細胞，分為對照組活化CD4+T細胞(CD3、CD28抗體共刺激72h)、MSCs共培養(yǎng)組(活化CD4+T細胞與MSCs共培養(yǎng)72h)和干擾素-γ(IFN-γ)預(yù)刺激后MSCs共培養(yǎng)組(活化CD4+T細胞與IFN-γ預(yù)刺激后的MSCs共培養(yǎng)72h)，活化CD4+T細胞組為對照。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中TGF-β1、IL-6、IL-10因子水平。結(jié)果 相對于活化CD4+T細胞組，MSCs共培養(yǎng)組培養(yǎng)上清中TGF-β1、IL-6、IL-10濃度均顯著升高(P≤0.01)，并且活化的CD4+T細胞增殖受到抑制。結(jié)論 MSCs通過促分泌TGF-β1、IL-6、IL-10抑制活化的CD4+T細胞增殖，起到免疫抑制作用。

干燥綜合征； 臍帶間充質(zhì)干細胞； TGF-β1； IL-6； IL-10； 免疫抑制效應(yīng)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome，pSS)是一種以淚腺和唾液腺等外分泌腺高度淋巴細胞浸潤為特征的彌漫性結(jié)締組織病，病理機制不明，唾液腺上皮功能紊亂與自身反應(yīng)性T細胞活化是其重要機制[1]。臨床表現(xiàn)復(fù)雜，最常見的癥狀是口、眼干燥，且常伴有內(nèi)臟損害而出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)，部分患者可向惡性淋巴瘤發(fā)展。免疫功能紊亂為其發(fā)病及病變延續(xù)的主要基礎(chǔ)，確切病因仍不十分清楚，目前尚無根治的方法。有研究[2]提示，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)的缺陷參與了pSS的疾病發(fā)生，MSCs作為一種有效的治療pSS的新方法正日益受到關(guān)注[2]。

MSCs具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，能調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫[3-4]，將MSCs加入體外的活化T細胞培養(yǎng)體系中，可抑制T細胞活化與增殖，減少炎性細胞因子干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α、IL-6和IL-17等的產(chǎn)生，同時增加抗炎因子IL-4、IL-10等的水平[4]。在MSCs抑制CD4+T細胞方面，活化的CD4+T細胞可分泌IFN-γ，后者單獨或聯(lián)合TNF-α、IL-1α、IL-1β等作用于MSCs，使MSC抑制作用增強；雖然MSCs可以通過與靶細胞直接接觸，在免疫抑制中發(fā)揮一定作用，但其免疫抑制作用主要是通過分泌一些可溶性因子來實現(xiàn)，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、IL-6和IL-10等，從而抑制CD4+T細胞活性。本研究探討人臍帶MSCs促分泌的TGF-β1、IL-6和IL-10在pSS中的免疫抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

臍帶標(biāo)本取自同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院足月剖宮產(chǎn)新生兒，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)父母簽署知情同意，選取近胎兒段臍帶作為MSCs來源。新鮮抗凝外周血標(biāo)本取自同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院輸血科，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)獻血者本人簽署知情同意，選取健康者1例，女性24歲，pSS患者1例，女性46歲，主要表現(xiàn)為口眼干伴雙手雷諾現(xiàn)象10年，2年前明確診斷為pSS。

1.2 主要試劑和儀器

改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM/F12，1∶1)、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Human MSC Analysis Kit購自美國BD公司；Lymphoprep購自挪威Axis-shield公司；臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒購自上海碧云天公司；FITC anti-human CD4、Purified anti-human CD3、Purified anti-human CD28購自美國BioLegend公司；重組人干擾素γ購自美國PeproTech公司；人TGF-β1 ELISA試劑盒、人IL-6 ELISA試劑盒、人IL-10 ELISA試劑盒為上海西唐公司產(chǎn)品。

流式細胞儀BD FACSAria Ⅱ型購自美國BD公司； DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶標(biāo)儀、Multiskan Ascent分析軟件購自芬蘭Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs的分離、鑒定 無菌條件下取近胎兒段臍帶，分別用膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶消化，過濾，過濾后的細胞用含10%FBS、10ng/ml表皮細胞生長因子(epidermal growth factor， EGF)、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，細胞覆蓋率達到80%～90%時傳代。至第3代FCM鑒定細胞表面抗原CDl9、CD34、CD45、CDl1b、HLA-DR、CD73、CD90、CDl05。

1.3.2 CD4+T細胞的分離 按以下步驟分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。 將新鮮抗凝外周血用PBS 1∶1稀釋；將稀釋外周血沿傾斜的離心管壁緩慢加于淋巴細胞分離液上面；22℃，離心半徑5cm，2000r/min，離心20min，no brake剎車關(guān)閉)；吸取白膜層細胞即PBMC，重懸于2～5倍洗滌液中；1500r/min，離心10min)，棄上清液；洗滌(1500r/min，15min；1000r/min，10min；800r/min，10min；800r/min，5min)；加入10μl FITC-CD4抗體，冰上20～30min；流式細胞儀分選CD4+T細胞。

1.3.3 MSCs與CD4+T細胞體外共培養(yǎng) 分選成年健康者和pSS患者外周血CD4+T細胞，各分為3組： 對照組(活化CD4+T細胞與CD3、CD28抗體共刺激72h)、MSCs共培養(yǎng)組(活化CD4+T細胞與MSCs共培養(yǎng)72h)、IFN-γ預(yù)刺激后MSCs共培養(yǎng)組(活化CD4+T細胞與IFN-γ預(yù)刺激后的MSCs共培養(yǎng)72h)。共培養(yǎng)前48h在10cm培養(yǎng)皿中接種MSCs，接種細胞量為2×105/皿，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基將終體積調(diào)整為10ml，共培養(yǎng)前24h在IFN-γ預(yù)刺激后MSCs共培養(yǎng)組中加入rhIFN-γ(100ng/ml)，接種CD4+T細胞前全換液1次，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基將所有培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液體積調(diào)整為9ml；收集分選出的CD4+T細胞，調(diào)整細胞密度為2×106/ml，將細胞接種于上述含有MSCs的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿1ml，即2×106/皿，同時加入CD3抗體(1μg/ml)及CD28抗體(1μg/ml)，置37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。

1.3.4 CD4+T細胞計數(shù)及細胞活率檢測 應(yīng)用臺酚藍染色細胞存活率檢測試劑盒，從各組細胞懸液中吸取100μl轉(zhuǎn)移至相應(yīng)1.5ml EP管，加入100μl 臺酚藍染色液(2×)，輕輕混勻，染色3min，吸取10μl經(jīng)過染色的細胞，用血細胞計數(shù)板計數(shù)。

1.3.5 共培養(yǎng)上清液中可溶性因子檢測 將共培養(yǎng)上清液平衡至室溫，按以下步驟操作。(1) 加樣： 每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 40min；(2) 洗板： 用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干；(3) 每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μl(空白除外)；將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 20min；(4) 洗 板： 同前；(5) 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μl；將反應(yīng)板置37℃ 10min；(6) 洗板： 同前；(7) 每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應(yīng)15min；(8) 每孔加入100μl終止液混勻；(9) 30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值(D450)，檢測上清液中TGF-β1、IL-6、IL-10的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MSCs的鑒定

MSCs呈長梭形、纖維狀貼壁生長。經(jīng)流式細胞儀檢測MSCs陽性率為97.5%，流式鑒定結(jié)果： FITC-CD90(+)，PerCP-CyTM5.5 CD105(+)，APC-CD73(+)，而PE-CD45, CD34, CD11b, CD19，HLA-DR均(-)，見圖1。

圖1 人臍帶來源MSCs流式鑒定結(jié)果Fig.1 Human umbilical cord derived MSCs flow type identification results

2.2 FACS分選外周血CD4+T細胞

分離獲得的PBMC經(jīng)FACS分選CD4+T細胞，其中健康者PBMC中CD4+T細胞陽性率為17.8%，pSS患者PBMC中CD4+T細胞陽性率為23.2%。

2.3 MSCs抑制CD4+T細胞增殖

CD4+T細胞接種量為2×106/皿，在加入CD3、CD28抗體共刺激后CD4+T細胞增殖至2.5×106，MSCs共培養(yǎng)組CD4+T細胞數(shù)減少至1.8×106，提示MSCs能抑制活化的CD4+T細胞增殖，尤其在用IFN-γ預(yù)刺激MSCs后，CD4+T細胞數(shù)減少至1.14×106。

2.4 培養(yǎng)上清液中的可溶性因子水平

與活化CD4+T細胞組相比，健康者MSCs共培養(yǎng)組和IFN-γ預(yù)刺激后MSCs共培養(yǎng)組TGF-β1水平均有升高(P<0.01和P=0.01)；IL-6水平升高(P<0.01)，IL-10水平有升高(均P<0.01)。與活化CD4+T細胞組相比，pSS患者MSCs共培養(yǎng)組和IFN-γ預(yù)刺激后MSCs共培養(yǎng)組TGF-β1水平均有升高(P<0.01)，IL-6水平均升高(均P<0.01)，IL-10水平均升高(P<0.01)，見表1。

表1 健康者和pSS患者培養(yǎng)上清液中的TGF-β1、IL-6、IL-10濃度比較

與活化CD4+T細胞組比較，*P<0.01

3 討 論

本研究結(jié)果證實，相對于活化CD4+T細胞單獨培養(yǎng)組，當(dāng)培養(yǎng)體系中存在MSCs時TGF-β1、IL-6、IL-10濃度均顯著升高(P≤0.01)，而活化的CD4+T細胞增殖受到抑制，故推測MSCs可能通過促進自身細胞或CD4+T細胞分泌TGF-β1、IL-6、IL-10抑制活化的CD4+T細胞增殖。本實驗以活化CD4+T細胞組為對照，故未設(shè)MSCs單獨治療組，究竟是MSCs還是CD4+T細胞在其中占主導(dǎo)作用尚有待進一步研究。在體外培養(yǎng)環(huán)境中，本研究采用CD3抗體和CD28抗體刺激T細胞增殖，盡管不能完全反映體內(nèi)的真實免疫情況，但是通過這種模型證實了MSCs在體外可以顯著抑制T淋巴細胞增殖；MSCs通過促分泌免疫抑制性細胞因子如TGF-β1、IL-6、IL-10等途徑構(gòu)建局部免疫微環(huán)境，發(fā)揮免疫抑制作用。

MSCs在體外實驗中可以抑制活化的CD4+T細胞增殖，有文獻[5]報道其免疫抑制作用呈劑量依賴性，因此本研究中控制MSCs與T細胞比例為1∶10，共培養(yǎng)后通過細胞計數(shù)可以觀察到顯著的抑制效果，用IFN-γ預(yù)刺激MSCs可以增強其免疫抑制作用，進一步抑制T細胞增殖，與以往的報道一致，證實了MSCs在體外對活化CD4+T細胞的免疫抑制效應(yīng)。而且，這種免疫抑制作用沒有MHC限制性，實驗中與效應(yīng)T細胞HLA不合的第三方MSCs仍可抑制其增殖。

在MSCs抑制CD4+T細胞方面，體外研究排除了MSCs誘導(dǎo)T細胞凋亡的可能性，指出MSCs與T淋巴細胞間的直接接觸和MSCs分泌的可溶性因子對T細胞的間接抑制作用是MSCs的免疫調(diào)節(jié)機制之一。DiNicola等[6]采用Transwell小室用聚碳酸酯膜將MSC與T細胞分開培養(yǎng)，MSC仍然可以抑制T細胞增殖，故推斷MSC對T細胞增殖的抑制作用并不嚴(yán)格依賴于細胞之間的直接接觸，MSC分泌的可溶性因子也參與其中。本研究證實，相對于活化CD4+T細胞單獨培養(yǎng)組，當(dāng)培養(yǎng)體系中存在MSCs時TGF-β1、IL-6、IL-10濃度均顯著升高(P≤0.01)，這些因子可能主要由MSCs分泌，在MSCs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)中起重要作用。

目前，在MSCs誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究中，還提出其他各種假說，包括吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)介導(dǎo)[7]，抑制T細胞有絲分裂[8]從而將活化T細胞阻抑在G0/G1期[3]，抑制單核細胞分化為樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)以減少抗原提呈[9]以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞[10]等。結(jié)合本研究考慮，MSCs可能通過促分泌TGF-β1、IL-6、IL-10等可溶性因子誘導(dǎo)以上免疫抑制效應(yīng)，而且這可能與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的啟動有關(guān)。

此外，微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)在細胞因子表達調(diào)控中的作用日益受到關(guān)注，在細胞因子調(diào)節(jié)的多個環(huán)節(jié)都有miRNA直接或間接的調(diào)控，而且miRNA調(diào)節(jié)不同于“開/關(guān)”調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為定量基因調(diào)節(jié)，能精細調(diào)節(jié)細胞響應(yīng)外界影響。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞因子的產(chǎn)生、基因的活化與轉(zhuǎn)錄等影響T細胞的活化與增殖[11]，而TGF-β、IL-10等細胞因子能以不同機制改變細胞miRNAs表達，進而影響細胞功能[12-13]，而這些細胞因子均能由MSCs促分泌并發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，故有必要進一步闡明MSCs是否可通過促分泌上述可溶性因子來調(diào)控pSS的CD4+T細胞內(nèi)異常miRNAs，改變活化CD4+T細胞部分miRNAs的表達，從而抑制CD4+T細胞活化、增殖。

總之，MSCs的細胞療法為pSS患者提供了一種值得嘗試的治療方法。TGF-β1、IL-6、IL-10等可溶性因子甚至相關(guān)的miRNAs均可能成為新的免疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)，調(diào)節(jié)患者的CD4+T細胞以達到免疫抑制效應(yīng)。能人為地調(diào)節(jié)患者的CD4+T細胞以優(yōu)化pSS診斷和治療。但是，鑒于pSS中信號通路網(wǎng)的復(fù)雜性，目前仍不清楚MSCs促分泌的可溶性因子影響T細胞發(fā)育、分化、活化及功能效應(yīng)的確切機制，尚需要更為深入的研究。

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Mesenchymal stem cells inhibit activation and proliferation of CD4+cells in Sj?gren syndrome by promoting TGF-β1, IL-6 and IL-10 secretion

FANGXing-xing，LUZhen-hao，TANGJian-ping，F(xiàn)ENGRun，YANGShao-ying，GONGBang-dong

(Dept. of Rheumatology and Immunology，Tongji University，Shanghai 200065， China)

Objective To investigate the immune suppression effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on the activation of peripheral blood CD4+T cells in primary Sj?gren syndrome (pSS)invitro, and analyze the immunosuppressive effects of transforming growth factor-β1 (TGF-β1 ), IL-6 and IL-10 promoted by MSCs. Methods Primary cultured umbilical cord MSCs were identified by flow cytometry (FCM)，and peripheral blood CD4+T cells were sorted both in healthy adults and in pSS patient. CD4+T cells were cultured with CD3, CD28 antibody for 72h to be activated (control group)； the activated CD4+T cells were co-cultured with MSCs for 72h (MSCs group)or MSC were pre-stimulated with interferon-γ (IFN-γ)， then the activated CD4+T cells were co-cultured with pre-stimulated MSCs for 72h (pre-stimulated group). TGF-β1, IL-6 and IL-10 in the supernatants were detected by ELISA.Results Compared with control group, levels of TGF-β1, IL-6 and IL-10 were significantly increased in MSCs group and pre-stimulated MSCs group(P≤0.01), and CD4+T cell activation was inhibited. Conclusion MSCs may have an immunosuppressive effect，which can inhibit the proliferation of activated CD4+T cells by promoting the secretion of TGF-β1, IL-6 and IL-10.

Sj?gren syndrome； umbilical cord mesenchymal stem cells； TGF-β1； IL-6； IL-10； immunosuppressive effects

10.16118/j.1008-0392.2016.04.006

2016-02-06

國家自然科學(xué)基金(81273295)；教育部留學(xué)回國人員基金(20101174)；上海市衛(wèi)生局基金(2011276)

房星星(1983—)，女，住院醫(yī)師，碩士.E-mail： xingxing_fang@126.com

湯建平.E-mail： tangjp6512@126.com

R 817.5

A

1008-0392(2016)04-0031-05