楊 波， 溫曉飛， 劉 輝， 劉 峰, 鄧曉俊, 廖國強

(1. 上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院泌尿外科，上海 201318； 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院泌尿外科，上海 200120)

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miR-1721靶向CD44抑制前列腺癌PC-3細胞增殖、侵襲和腫瘤干細胞形成的研究

楊 波1， 溫曉飛2， 劉 輝1， 劉 峰1, 鄧曉俊1, 廖國強1

(1. 上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院泌尿外科，上海 201318； 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院泌尿外科，上海 200120)

目的 探討miR-1721靶向抑制CD44的表達及對前列腺癌細胞增殖、侵襲能力的影響。方法 構建CD44 mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的熒光素酶報告載體系統(tǒng)，通過熒光素酶系統(tǒng)確定miR-1721對CD44 mRNA 3′-UTR的靶向關系；脂質體轉染法將miR-1721模擬物轉入前列腺癌PC-3細胞中，Western印跡法檢測轉染后CD44蛋白表達水平的改變；MTT法檢測miR-1721mimics對PC-3細胞增殖能力的影響，Transwell小室法檢測其對腫瘤細胞襲侵襲能力的影響；通過干細胞成球實驗檢測miR-1721mimics對前列腺癌干細胞樣微球體形成的影響。結果 miR-1721能特異性地與CD44 mRNA 3′-UTR結合，抑制其熒光素酶的活性，干細胞標記基因CD44是miR-1721的靶基因。過表達miR-1721的PC-3細胞中CD44蛋白表達水平明顯降低，可顯著抑制PC-3細胞的侵襲能力，同時過表達CD44可負調控miR-1721對PC-3細胞增殖和侵襲能力的影響；干細胞成球實驗證實，miR-1721能顯著抑制前列腺癌細胞PC-3干細胞的微球體形成能力。結論 miR-1721通過靶向調控CD44的表達而抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲能力及干細胞的形成能力。

前列腺腫瘤； CD44； 干細胞標記基因； miRNAs

近年來，人們對干細胞的研究顯示腫瘤起源于腫瘤干細胞[1]。腫瘤干細胞具有自我更新能力和分化潛能，是腫瘤細胞生長、增殖和遠處轉移的根源[2]。腫瘤干細胞具有正常干細胞的自我保護特性，如DNA損傷修復、高表達多藥耐藥型膜轉運蛋白、處于相對靜止狀態(tài)以及擁有特定的細胞微環(huán)境，均能使其逃逸現有的腫瘤治療手段，最終導致腫瘤復發(fā)和轉移[1,3]。

miRNAs是一類內源性的19～35個核苷酸的小分子物質，主要在轉錄后水平調控基因的表達[4]，其自我更新能力可能是腫瘤發(fā)生、耐受和復發(fā)的直接原因。Chikamatsu等[5]在膠質母細胞瘤中的研究表明，miRNAs在未分化的干細胞中存在與腫瘤細胞相似的異常表達，這些異常表達的miRNAs通過調節(jié)腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)相關通路促進其自我更新。在造血干細胞中，高表達的miR-17、miR-92激活的Hh信號通路，加速淋巴瘤的惡性發(fā)展[6]。在結直腸癌中，高表達的miR-135a、miR-136b和APC的下調使得β-catenin上調，從而激活Wnt通路，促進結、直腸癌CSCs的自我更新，導致腫瘤發(fā)展與轉移[7]。

有研究顯示，前列腺癌起源于前列腺基底干細胞。Maitlant等[8]首先用免疫磁珠和膠原黏附法分選出CD44+整合素α2β1+前列腺細胞，發(fā)現這些細胞具有干細胞特性。Lang等[9]證實了前列腺腫瘤干細胞的存在。前列腺干細胞和前列腺腫瘤干細胞均存在于CD44+的基底細胞內，表現增殖潛力[10]。本研究通過miR-1721靶向調控CD44的表達對前列腺癌細胞增殖和侵襲能力進行研究，探討miR-1721在前列腺癌腫瘤干細胞中的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

PC-3細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，收集對數生長期的細胞進行后續(xù)操作。分為miR-1721模擬物(mimics)組和陰性對照組。根據LipofectAMINE 2000說明書進行細胞轉染。轉染后72h收集細胞進行RNA和蛋白質抽提實驗。待細胞生長處于對數期進行轉染siRNA。

1.2 主要試劑及儀器

miR-1721模擬物(mimics)和陰性對照購自上海艾博斯生物科技有限公司產品；10%胎牛血清(Cata： C2027050)購自美國Gibco公司；雙抗(100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，Cata： 15140-148)購自美國Invitrogen公司；CD44兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司；工作液稀釋比例為1∶100。鋪有基質膠的Transwell侵襲小室購自美國Biosciences公司；Cy3標記的山羊抗兔二抗、SP免疫熒光化學試劑盒購自上海市艾博斯生物科技有限公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司;LipofectAMINE-2000購自美國Invitrogen公司；普通實驗室冰箱、溫育箱、溫盒和恒溫振蕩器等均由周浦醫(yī)院中心實驗室提供。

1.3 CD44 mRNA 3′-UTR熒光素酶報告載體的構建

根據反轉錄試劑盒說明進行操作。根據CD44 mRNA 3′-UTR的序列特點，設計末端帶SpeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的特異性引物序列如下。上游引物： 5′-UUUUUCAGAUGCUUCUGGGAGAC-3′，下游引物： 5′-GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU-3′。以正常人血細胞DNA為模板，PCR擴增CD44 mRNA 3′-UTR的部分片段(第564～570位堿基)。將PCR產物及preMIR-Report-luciferase報告載體(Promega公司)分別用限制性內切酶SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切處理后，通過純化、連接和轉化等常規(guī)步驟進行構建，挑取陽性克隆并測序鑒定。

1.4 熒光素酶活性的檢測

將熒光素酶報告載體CD44-Wt和CD44-Mut分別與miR-1721mimics或miR-1721inhibitor兩兩組合共轉染前列腺癌PC-3細胞，轉染步驟參見LipofectAMINE-2000操作說明；miRNA-1721的終濃度為40μmol/L，轉染細胞數為1×105個。轉染48h后，收獲細胞。按雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書處理細胞并在單光子檢測儀上檢測細胞熒光素酶活性。計算相對熒光素酶活性： 熒光素酶活性= 螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力

取對數生長期PC-3細胞，以1×105/ml接種于96孔板中，每孔100μl。培養(yǎng)36h后，轉染miRNA mimics和NC，轉染8h后更換含10%胎牛血清培養(yǎng)基，分別于24、48、72、96h進行增殖活力檢測(5個復孔)。藥物組在轉染后24h加入多胺類似物二乙基去甲精胺(DENSPM)，終止培養(yǎng)前每孔加入10μl的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)，同時設空白對照組(加10μl培養(yǎng)基)，3h后酶標儀檢測490nm處吸光度值(D490)。抑制率=(對照組D490-實驗組D490)/對照組D490×100%。

1.6 Transwell細胞侵襲實驗檢測轉染后PC-3細胞侵襲能力

將鋪有基質膠的Transwell小室預熱至37℃，消化轉染后的各組細胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，無血清培養(yǎng)液重懸細胞后計數，調整細胞密度為1×105/ml。在Transwell下室加入1ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。在Transwell上室加入300μl細胞懸液，37℃培養(yǎng)36h。取出Transwell小室，試紙拭去上室側膜的細胞，PBS洗滌后，用4%的多聚甲醛溶液固定細胞10min，結晶紫染色，光學顯微鏡下觀察細胞染色情況并照相，隨機選取5個高倍視野(×100)進行細胞計數，計算平均值。

1.7 干細胞成球實驗

將人前列腺癌PC-3細胞消化后計細胞數，以1×105個的細胞密度接種至6孔板中，然后加入干細胞培養(yǎng)液： 含2%胎牛血清、胰島素10μg/ml、表皮生長因子(epidermal growthfactor，EGF)20ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)20ng/ml、B27 20ng/ml和氫化可的松500ng/ml。置于37℃、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)36h，分別轉染miR-1721mimics以及miR-1721inhibitor，培養(yǎng)72h后在倒置光學顯微鏡下觀察干細胞成球的大小及數量(×200倍)并拍照。

1.8 Western印跡法檢測相關蛋白的表達

待細胞轉染72h后，收集各轉染組細胞，加入RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA法進行蛋白質定量。各取對照組和轉染組總蛋白30～50μg進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5% BSA封閉1h，一抗4℃孵育過夜。加入二抗(1∶5000)，37℃孵育1h，PBS洗滌3次，Odessy分析儀上機掃膜分析。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 雙熒光素酶報告驗證miR-1721和CD44的靶向關系

將熒光素酶活性與陰性對照組進行比較，結果顯示共轉染pMIR-REPORT及miR-1721mimics的PC-3細胞組熒光素酶值是轉染pMIR- Report及mimics NC組的PC-3細胞組熒光素酶值的43.6%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。熒光素酶活性檢測結果顯示，在共轉染miR-1721 mimics和重組質粒的CD44-Wt或CD44-Mut的PC-3細胞中，miR-1721 mimics對突變型pCD44-Mut組中的熒光素酶活性強度無明顯影響，但在野生型pCD44-Wt組中熒光素酶的活性強度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-1721靶向抑制人前列腺癌PC-3細胞中CD44的表達結果Fig.1 Dual luciferase reporter system show the miR-1721 validated the expression of CD44 in human prostate cancer PC-3 cell lineA： mir-1721的結合位點CD44 mRNA 3′-UTR；B： 不同組熒光素酶活性比較；與miR-1721 mimics組相比，**P<0.01

2.2 MTT法和Transwell檢測細胞增殖和侵襲能力結果

分別以100nmol/L濃度的miR-1721mimics和inhibitor作用于人前列腺癌細胞株PC-3細胞24、48、72、96h后，與對照組相比較，miR-1721抑制作用一定程度上呈時間依賴性。當作用時間為96h、濃度為100nmol/L時的miR-1721mimics，對該株細胞的增殖抑制作用最強，抑制率為43.9%(P<0.05)，見圖2。Transwell實驗結果顯示，miR-1721-mimics組穿過基質膠的PC-3細胞明顯少于miR-1721 inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這一結果說明，miR-1721對PC-3細胞的侵襲能力有顯著抑制作用，見圖3。

圖2 miR-1721對前列腺PC-3細胞的抑制作用Fig.2 miR-1721 inhibits PC-3 cell proliferation in time dependent與miR-1721 inhibitor組相比，*P<0.05，**P<0.01

圖3 轉染miR-1721后細胞侵襲能力Fig.3 Migration of prostate cancer PC-3 cells after transfected(×100)與miR-1721 inhibitor組相比，*P<0.05

2.3 miR-1721負性調控CD44蛋白的表達

蛋白質免疫印跡法檢測結果顯示，miR-1721mimics組中CD44蛋白的表達水平較miR-1721 inhibitor組明顯降低，灰度分析結果顯示轉染后CD44蛋白表達顯著受到抑制，抑制率48.9%，見圖4。

圖4 轉染miR-1721后PC-3細胞中CD44蛋白的表達Fig.4 Western blotting analysis of CD44 protein levelsA： Western印跡法分析CD44蛋白水平；B： 不同組細胞CD44蛋白水平比較；與miR-1721inhibitor組相比，*P<0.05

2.4 miR-1721可顯著抑制誘導PC-3干細胞的成球能力

采用干細胞培養(yǎng)液從前列腺癌PC-3細胞株中分離得到的PC-3成球前列腺癌腫瘤干細胞，將miR-1721mimics和miR-1721inhibitor分別轉入PC-3成球干細胞中，96h后PC-3細胞成球能力顯著下降，成球大小和數量顯著下降，見圖5。

圖5 miR-1721對前列腺癌PC-3干細胞微球體細胞形成的作用Fig.5 Effect of miR-1721 on mammosphere and the size of PC-3 stem cells與miR-1721inhibitor組相比，*P<0.05

3 討 論

Reya等[11]在比較了腫瘤細胞和干細胞的特性之后，提出了“腫瘤干細胞”的概念，即在腫瘤組織中存在一小群具備自我更新和不定向分化潛能的細胞群，它們是各種腫瘤形成的起始細胞，而絕大部分腫瘤細胞只具備有限的增殖能力。

Hanlon等[12]發(fā)現超過65%的慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者中有miR-16與miR-15的高表達。隨后一些研究表明，在一些重要腫瘤如乳腺癌、膀胱癌、食管癌、前列腺癌和胰腺癌中存在特異miRNAs的表達[13-14]。Blenkiron等[15]在93例乳腺癌病例中根據miRNAs表達差異將乳腺癌分為4種分子類型(腺樣A，腺樣B，基底樣型和HER2陽性)。根據miRNAs表達差異與ER表達不同進一步將HER2陰性即基底樣型分為兩種亞型，HER2-/ER+和HER2-/ER-。同一種miRNA在不同的腫瘤中均具有相同生物學作用，如高表達的miR-21在頭頸部腫瘤細胞系抑制癌基因的轉錄，在乳腺癌中增加乳腺癌細胞的致瘤性，在神經膠質瘤動物模型中敲除miR-21能抑制腫瘤細胞的致瘤性。研究表明，自我更新能力是CSCs最重要的特征，基因改變或者表觀遺傳學的改變導致CSCs的自我更新能力失調控。自我更新能力可能是腫瘤發(fā)生、化療耐受、腫瘤復發(fā)的主要原因。Murata等[16]在膠質母細胞瘤中的研究表明，miRNAs在未分化的干細胞中存在與腫瘤細胞相似的異常表達，這些異常表達的miRNAs通過調節(jié)CSCs相關通路促進其自我更新能力。有研究顯示，let-7負向調控RAS、HMGA2，而RAS對于維持CSCs的自我更新能力至關重要，沉默RAS將降低球囊形成率、克隆增殖以及致瘤性。此外，在白血病中miR-15a和miR-16-1低表達引起B(yǎng)cl-2高表達從而抑制細胞凋亡[17]。在前列腺癌中miR-15a和miR-16-1的下調將激活Wnt通路，從而促進腫瘤細胞增殖與侵襲。Bcl-2與Wnt通路是維持CSCs的自我更新能力的必要條件[18]。

近年來，研究者已在多種實體腫瘤中鑒定出各種干細胞特異性的表面標志物，其中CD44和CD133是得到了廣泛認可的標志物。本實驗結果提示miR-1721可通過靶向調控CD44表達抑制前列腺癌腫瘤細胞和其干細胞的增殖和侵襲能力。利用CSCs的生物學特征，開發(fā)對其有殺傷作用的特異的藥物而達到治療作用也許會是行之有效的腫瘤靶向治療思路。

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miR-1721 suppresses proliferation and invasion of prostate cancer cells and its stem cells by targeting CD44

YANGBo1，WENXiao-fei2,LIUHui1,LIUFeng1，DENGXiao-jun1，LIAOGuo-qiang1

(1. Dept. of Urology, Shanghai Zhoupu Hospital, Shanghai University of Medicine & Health Sciences, Shanghai 201318, China; 2. Dept. of Ulology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the effect of miR-1721 on the proliferation and invasion of prostate cancer cells by targeting CD44. Methods The CD44 3′-untranslated region mRNA-luciferase reporter vector was constructed and the dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-1721 on activity of luciferase. Prostate cancer PC-3 cells were transfected with miR-1721 mimics by LipofectAMINE-2000, and the expressions level of CD44 protein was detected by Western blotting. The inhibition effects of CD44 on cell proliferation and invasion were observed after CD44 siRNA were transfected into PC-3 cells. PC-3-sc cells mammosphere assay was performed after cotransfection with miR-1721 mimics and CD44 siRNA. Results miR-1721 could bind to the 3′-UTR of CD44 and inhibited the activity of luciferase. Then CD44 protein expression was significantly down-regulated when miR-1721 was overexpressed in PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 inhibited the invasion of PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 antagonized a role of proliferation and invasion in PC-3 cells. Overexpression of miR-1721 reduced mammosphere number and the size of prostate cancer stem cells. Conclusion The miR-1721 expression can suppress cell proliferation and invasion by targeting CD44 in prostate cancer cells.

prostate carcinoma; CD44; stem cell genetic marker; miRNAs

10.16118/j.1008-0392.2016.04.005

2015-12-04

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題(20134428)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人培養(yǎng)計劃(PWRd2011-08)；吳階平醫(yī)學基金(320.6750.14197)

楊 波(1971—)，男，副主任醫(yī)師、副教授，博士研究生.E-mail： paulyang228@hotmail.com

R 737.25

A

1008-0392(2016)04-0025-06