董曉燕, 張 榮， 陳信良

(1. 克拉瑪依市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 克拉瑪依 834000； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院婦科，上海 200030)

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慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾LOX表達(dá)對人陰道壁成纖維細(xì)胞彈性蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)的影響

董曉燕1, 張 榮1， 陳信良2

(1. 克拉瑪依市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 克拉瑪依 834000； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院婦科，上海 200030)

目的 探討人陰道壁成纖維細(xì)胞中賴氨酸氧化酶(lysine oxidase， LOX)的表達(dá)在盆腔器官脫垂發(fā)生中的可能機(jī)制。方法 選取絕經(jīng)前、后無癥狀對照組的陰道前壁組織，用酶消化+組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。針對LOX基因，設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個慢病毒干擾載體(LOX-RNAi-LV)，分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，Real-Time PCR檢測LOX的表達(dá)情況，篩選出其中1個干擾效率最高的LOX-RNAi-LV，將其包裝成慢病毒并測定效價(jià)，將慢病毒感染人陰道壁細(xì)胞，Real-Time PCR檢測細(xì)胞中彈性蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 培養(yǎng)出絕經(jīng)前、后無癥狀對照組的陰道前壁成纖維細(xì)胞各4例，成功篩選出了具有較高干擾效率的LOX-RNAi-LV并成功包裝入慢病毒，感染慢病毒的人陰道前壁成纖維細(xì)胞，彈性蛋白表達(dá)均降低，MMP-2表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 LOX-RNAi-LV慢病毒感染后的人成纖維細(xì)胞彈性蛋白表達(dá)降低，MMP-2表達(dá)增高，因此推測LOX對彈性蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。

賴氨酰氧化酶； 盆腔器官脫垂； RNAi； 慢病毒； 彈性蛋白； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2

盆腔臟器脫垂(pelvic organ prolapse， POP)是中老年婦女的常見病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase, LOX)的表達(dá)異常與盆腔臟器脫垂的發(fā)生密切相關(guān)，但LOX的作用機(jī)制尚不清楚[1]。本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和構(gòu)建LOX慢病毒干擾載體(LOX-RNAi-LV)抑制人陰道壁成纖維細(xì)胞中LOX基因表達(dá)，檢測相關(guān)因子彈性蛋白(elastin, ELN)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)的表達(dá)變化，探討LOX在盆腔臟器脫垂發(fā)生中的作用機(jī)制，為POP的預(yù)防和治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月至2013年6月于同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦科因婦科良性疾病而無POP和(或)SUI行全子宮切除術(shù)患者陰道組織10例。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會通過。標(biāo)本采集經(jīng)患者和家屬同意。

1.2 主要材料

大腸桿菌TOP1O、DH5oL菌株由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院提供；HEK-293T細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；Real-Time PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；LipofectAMIN 2000購自美國Invitrogen公司；病毒包裝系統(tǒng)Lenti-Easy Packaging Mix為中國Genechem公司產(chǎn)品；鼠抗人Vimentin(E-5)單克隆抗體(sc-373717)一抗、GFP抗體購自美國Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購自中杉金橋公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM及胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.3 體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

手術(shù)室無菌條件下，取手術(shù)所得陰道前壁組織約0.5cm3于冰生理鹽水中沖洗掉血液，以手術(shù)刀仔細(xì)修剪、剔除黏膜、脂肪等非結(jié)締組織，將標(biāo)本移入盛有含雙抗(100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素)的PBS溶液，置于冰上，迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞臺。采用胰酶消化+組織塊法培養(yǎng)： 陰道壁組織標(biāo)本先用含雙抗的PBS液清洗血跡3～5次，用顯微外科剪將韌帶剪成大小約1mm3的碎塊置于15ml 離心管內(nèi)，加入組織量2～3倍的0.2% Ⅰ 型膠原酶消化液，混勻，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)消化60min。消化結(jié)束后，離心半徑10cm，1000r/min,離心5min，棄去上清液。組織塊用PBS清洗，離心半徑10cm，1000r/min，離心5min，共重復(fù)3次，棄去上清液。消化后的組織塊均勻放入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置8h，培養(yǎng)瓶側(cè)壁小心加入20% FBS-DMEM高糖培養(yǎng)液，使組織塊浸沒在培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)。6d后首次更換培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)變化并拍照。原代細(xì)胞生長至80%融合時進(jìn)行細(xì)胞傳代，能順利傳代視為培養(yǎng)成功。

取P3代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，并對該細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白(Vimentin)的細(xì)胞免疫化學(xué)染色： 待細(xì)胞生長至約70%融合。用PBS洗5min×2次，4.0%多聚甲醛溶液室溫固定15min。用PBS洗5min×3次。0.5% Triton透化2min，PBS漂洗5min×2次。10%血清室溫孵育封閉30min后，棄封閉液。加人1∶100稀釋的小鼠抗波形蛋白單克隆抗體(一抗)，用BSA作陰性對照，置入濕盒，4℃過夜。PBS洗5min×3次，分別用1∶50稀釋的FITC熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(二抗)，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×3次，對照組中一抗二抗均為PBS。避光處，待爬片晾干，加DAPI，室溫孵育4min，PBS洗3次，用手晃動洗滌。避光處，待爬片晾干，用抗熒光淬滅封片劑，4℃避光保存。在共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。

1.4 LOX慢病毒干擾載體的構(gòu)建和病毒包裝

1.4.1 設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個慢病毒干擾載體(LOX-RNAi-LV)，轉(zhuǎn)染并進(jìn)行篩選 根據(jù)Genbank公布的人LOX基因序列(NM_001178102)，使用Oligo Designer3.0設(shè)計(jì)針對LOX的4個干擾片段和1個陰性對照，靶序列如下。LOX1： 5′-CGACAACCC-TTATTACAACTA-3′，LOX2： 5′-CCAAGGGACA-TCAGATTTCTT-3′，LOX3： 5′-CTGCACAATTTCA-CCGTATTA-3′，LOX4： 5′-CCTGGCTGTTATGAT-ACCTAT-3′。將合成的序列退火(95℃ 5min，85℃ 5min，75℃ 5min，70℃ 5min)，形成雙鏈DNA與酶切后的hU6-MCS-CMV-EGFP載體相連,見圖1。轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli.TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在50μg/ml Ampicillin LB平板上進(jìn)行陽性克隆的篩選，陽性菌液進(jìn)行測序鑒定，測序引物序列： 5′-CCATGATT-CCTTCATATTTGC-3′，提取質(zhì)粒。

為了篩選出干擾效率最高的1個LOX-RNAi-LV，將5個干擾載體(LOX1、2、3、4、NC)分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，命名為LOX1組、LOX2組、LOX3組、LOX4組，LOX-NC組為陰性對照組，不做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組。HEK-293T細(xì)胞消化接種于6孔板，密度為3×105/ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，每孔加入4μg 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染過程按LipofectAMINE 2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為： 5×primer script buffer 4μl，Random6 mers 1μl，PrimeScript RT Enzyme mix 1μl，Oligo dT Primer 1μl，RNA 1μg，用RNAse-Free的水補(bǔ)足至20μl。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15min，85℃ 5s，所得cDNA用于PCR擴(kuò)增。以18s-RNA作為內(nèi)參照，用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，通過BLAST驗(yàn)證引物的特異性，引物均跨越兩個相鄰的外顯子。所采用的引物序列引物序列如下。18s-RNA上游引物： 5′-TACTCAACACCAACATCGATGGGC-3′，下游引物： 5′-GCTTTCCTCAACACCACATGAGCA-3′；LOX上游引物： 5′-GCTCAGATTTCCCCAAAGAGTGA-3′，下游引物： 5′-TGGCATCAAGCAGGTCATAGTG-3′。引物均由上海生物工程公司合成?；谑褂肧YBR Green熒光染料對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號進(jìn)行實(shí)時檢測以得到對起始模板的定量分析。

1.4.2 將最高效率LOX-RNAi-LV進(jìn)行病毒包裝并測定效價(jià) 篩選出的干擾效率最高的LOX-RNAi-LV，測序正確后進(jìn)行慢病毒包裝和測定病毒效價(jià)。包裝成的慢病毒命名為LOX-SR。取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每個10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿5×106個細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM 5ml，將25μl Lent-Easy Packaging Mix和3g慢病毒干擾載體按操作說明書共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑用LipofectAMIN 2000，6h后，將培養(yǎng)基更換為5ml含50μl丁酸鈉(110mg/ml)的完全培養(yǎng)基(10%FBS+DMEM+1%P/S)，再過6h后，將培養(yǎng)基更換為10ml正常完全培養(yǎng)基(10%FBS+DMEM+1%P/S)，48h后收集病毒上清液，離心去除細(xì)胞殘余，用濾器過濾分裝，保存于-80℃冰箱中。用倍比稀釋法感染HEK-293T細(xì)胞測定病毒效價(jià)，在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞數(shù)量，病毒效價(jià)為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)倍數(shù)。

1.5 LOX降表達(dá)成纖維細(xì)胞中彈性蛋白、MMP-2的表達(dá)的測定

1.5.1 LOX降表達(dá)模型的建立 人陰道壁成纖維細(xì)胞用添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，感染前1d將生長狀態(tài)良好的人陰道壁成纖維細(xì)胞以4×104/ml，體積為2ml的密度接種于六孔板中，使第2天細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%。實(shí)驗(yàn)分組共分3組?？瞻讓φ战M： 成纖維細(xì)胞中不加入慢病毒；LOX降表達(dá)組： 細(xì)胞加入200μl(1×108TU/ml)LOX-RNAi-LV病毒液+3μl polybrene；陰性對照組： 細(xì)胞加入200μl(1×108TU/ml)LOX-NC病毒液+3μl polybrene。感染24h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h，熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。流式細(xì)胞儀分選慢病毒感染后帶綠色熒光的人陰道壁成纖維細(xì)胞，顯微鏡下觀察GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。傳代感染后的成纖維細(xì)胞，收集部分細(xì)胞，從mRNA水平檢測LOX的表達(dá)情況。

1.5.2 Real-Time PCR檢測細(xì)胞中彈性蛋白和MMP-2的mRNA表達(dá) 將流式分選后傳代培養(yǎng)的部分細(xì)胞收集，加入TRIzol裂解細(xì)胞，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-Time PCR檢測絕經(jīng)前后樣本培養(yǎng)的LOX降表達(dá)成纖維細(xì)胞中彈性蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人陰道壁成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

成功培養(yǎng)出8例無POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞，其中絕經(jīng)前、后各4例。細(xì)胞生長情況見圖1。

第4代成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色，所有培養(yǎng)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物Vimentin為陽性，見圖2。膠原消化+組織塊培養(yǎng)法能獲得高純度的成纖維細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 陰道壁成纖維細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Vaginal wall fibroblasts(×100)A： 剛遷出原代細(xì)胞，生長瘦小；B： 傳代細(xì)胞，生長呈梭形，少數(shù)呈多角形；C細(xì)胞呈魚群樣或渦流狀生長

圖2 共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光顯色Fig.2 Views of confocal fluorescence microscopy(×600)A： 細(xì)胞Vimentin陽性顯示為綠色熒光，B： 細(xì)胞核DAPI染色結(jié)果，C： 熒光顯色合成效果

2.2 最有效的LOX-RNAi-LV的篩選

將轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞進(jìn)行裂解獲取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過Real-Time PCR，結(jié)果顯示，LOX-3抑制效率最高，其抑制率>75%, Real-Time PCR分析LOX相對表達(dá)量，未轉(zhuǎn)染空白組與LOX-NC的LOX表達(dá)效率幾乎一致，其他組均明顯下降，LOX-3組LOX表達(dá)量最低，見圖3。

2.3 慢病毒病毒包裝效果和效價(jià)測定

使用LOX-RNAi-LV和Packaging Mix轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞24h后，在熒光顯微鏡下同一視野的熒光和明場照片，轉(zhuǎn)染了LOX重組質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞中可見較多的熒光著色細(xì)胞，對照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞未見熒光著色細(xì)胞，可見慢病毒載體被成功轉(zhuǎn)染，見圖4。

圖3 LOX-RNAi-LV篩選與干擾效率比較Fig.3 Screening of constructed LOX-RNAi-LV vectors

LOX-RNAi-LV慢病毒感染293T細(xì)胞72h后，熒光顯微鏡下觀察到較高比例的綠色熒光蛋白，倍比稀釋法測定慢病毒效價(jià)為： (18+22)/2×10-6=2×107TU/μl=2×1010TU/ml。

2.4 LOX-RNAi-LV慢病毒干擾人陰道壁成纖維細(xì)胞LOX的表達(dá)

慢病毒感染人陰道壁成纖維細(xì)胞LOX降表達(dá)

成功樣本共8例，絕經(jīng)前4例，絕經(jīng)后4例。慢病毒感染人陰道壁成纖維細(xì)胞96h，在熒光顯微鏡下觀察，可見較高綠色熒光蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分選后，各樣本中成纖維細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)率>90%，且傳代后細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，見圖5。

圖4 LOX-RNAi-LV轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的明場及熒光照片F(xiàn)ig.4 LOX-RNAi-LV HEK293T cells transfected with bright-field and fluorescence photo(×40)

圖5 流式熒光細(xì)胞分選后綠色熒光蛋白表達(dá)情況Fig.5 GFP expression after flow fluorescence cell sorting(×100)

Real-Time PCR檢測成纖維細(xì)胞LOX基因mRNA的表達(dá)水平，LOX降表達(dá)組細(xì)胞中LOX基因mRNA的表達(dá)水平較空白對照組顯著下降(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組細(xì)胞中LOX基因mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與預(yù)期值相符，見圖5。

LOX降表達(dá)組細(xì)胞中LOX基因mRNA的表達(dá)水平較空白對照組下降83.36%，而陰性對照組與空白對照組細(xì)胞中LOX基因mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與預(yù)期值相符?？瞻讓φ战M和陰性對照組LOX、ELN、MMP-2 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LOX降表達(dá)組ELN mRNA表達(dá)較空白組和陰性對照組分別降低80.99%和81.31%(P<0.05)，而LOX降表達(dá)組MMP-2的mRNA表達(dá)與空白組和陰性對照組比較，分別升高7.67倍與7.53倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

盆腔臟器主要由韌帶、肌肉和骨盆所支持，而盆底結(jié)締組織起到連接韌帶、肌肉和骨盆的作用。POP的發(fā)生與盆底支持組織中結(jié)締組織的彈性、韌性、功能的改變密切相關(guān)[1]。結(jié)締組織的主要組成細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在維持結(jié)締組織彈性和韌性中起著重要作用。LOX是一種銅依賴的單胺氧化酶，由促纖維化細(xì)胞表達(dá)和分泌，能催化細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和彈性纖維中賴氨酸殘基的交聯(lián)，以維持ECM的正常結(jié)構(gòu)和功能，在ECM中發(fā)揮基本的生物學(xué)功效[2]。

POP組陰道前壁組織中LOX表達(dá)量較無癥狀對照組明顯減少，提示LOX的表達(dá)減少與POP的發(fā)生有密切關(guān)系[3-4]。Klutke等[5]對8名POP婦女和8名無POP婦女的宮骶韌帶組織中LOX基因啟動子區(qū)域進(jìn)行研究，POP組共發(fā)現(xiàn)66個甲基化CpG位點(diǎn)，非POP組只發(fā)現(xiàn)1個甲基化CpG位點(diǎn)，提示LOX基因的啟動子區(qū)域甲基化可能會抑制LOX基因的表達(dá)，但目前無相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)啟動子區(qū)域甲基化與LOX的降表達(dá)及POP的發(fā)生之間的關(guān)系。

LOXL-1表達(dá)下降或缺失，可使彈性纖維的交聯(lián)受阻，形成不穩(wěn)定的彈性纖維，易于斷裂分解，導(dǎo)致盆底支持組織薄弱，最終導(dǎo)致POP。Alperin等[6]研究表明，LOXL1基因敲除小鼠其陰道支持組織的生物學(xué)行為發(fā)生改變。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LOXL1基因敲除小鼠分娩后出現(xiàn)POP的發(fā)病率比野生型小鼠高，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)尿道旁結(jié)締組織中彈性纖維數(shù)目減少，排列不規(guī)則，免疫染色顯示尿道平滑肌層細(xì)胞數(shù)目下降，排列紊亂。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)LOXL1基因缺陷的大鼠無法形成彈性蛋白聚合物。本研究發(fā)現(xiàn)，LOX降表達(dá)成功的成纖維細(xì)胞胞體變小、生長緩慢、細(xì)胞貼壁性降低，推測可能與LOX降表達(dá)后成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變有關(guān)。LOX降表達(dá)成功的陰道壁成纖維細(xì)胞與降表達(dá)前相比，彈性蛋白的mRNA表達(dá)水平明顯下降，由此從基因水平推測，LOX可能對彈性蛋白的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。

MMPs能影響局部組織中多種類型膠原蛋白的代謝功能，是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中的重要酶。目前研究表明,盆腔結(jié)締組織中MMP-l、MMP-2、MMP-9與盆底功能障礙性疾病的關(guān)系較密切[9-12]。MMP-1主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原。MMP-2參與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型膠原以及彈性蛋白的降解，同時，還能降解膠原酶的降解產(chǎn)物。Gabriel等[9]研究發(fā)現(xiàn)POP女性子宮骶韌帶中MMP-2表達(dá)明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，LOX降表達(dá)后的成纖維細(xì)胞MMP-2mRNA表達(dá)較降表達(dá)前明顯增加，提示LOX降表達(dá)后可引起細(xì)胞外ECM成分發(fā)生改變。

LOX表達(dá)降低可能使陰道前壁等盆腔器官支持組織中的膠原和彈性纖維交聯(lián)異常，機(jī)械強(qiáng)度降低，易于斷裂分解，或是對蛋白水解酶作用的敏感性增加，導(dǎo)致其功能異常，從而參與POP的發(fā)生。因此，通過干擾LOX表達(dá)，例如通過上調(diào)LOX內(nèi)源性表達(dá)或應(yīng)用外源性LOX替代，產(chǎn)婦分娩后補(bǔ)充LOX從而加強(qiáng)膠原與彈性纖維交聯(lián)、增強(qiáng)盆底支持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有望成為預(yù)防和治療POP的有效方法。

[1] De Landsheere L, Munaut C, Nusgens B, et al. Histology of the vaginal wall in women with pelvic organ prolapse： a literature review[J]. Int Urogynecol J, 2013,240(12)： 2011-2020.

[2] Kagan HM, Li W. Lysyl oxidase： properties, specificity, and biological roles inside and outside of the cell[J]. J Cell Biochem, 2003,88(4)： 660-672.

[3] Alarab M, Bortolini MA, Drutz H, et al. LOX family enzymes expression in vaginal tissue of premenopausal women with severe pelvic organ prolapse[J]. Int Urogynecol J, 2010,21(11)： 1397-1404.

[4] Zhang SQ, Zhang LL, Yu H. Expression of elastin, lysyl oxidase and elafin in the cardinal ligament of women with pelvic organ prolapse [J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 2008,43(9)： 675-679.

[5] Klutke J, Stanczyk FZ, Ji Q, et al. Suppression of lysyl oxidase gene expression by methylation in pelvic organ prolapse[J]. Int Urogynecol J, 2010,21(7)： 869-872.

[6] Alperin M, Debes K, Abramowitch S, et al. LOXL1 deficiency negatively impacts the biomechanical properties of the mouse vagina and supportive tissues[J]. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct, 2008,19(7)： 977-986.

[7] Liu G, Daneshgari F, Li M, et al. Bladder and urethral function in pelvic organ prolapsed lysyl oxidase like-1 knockout mice[J]. BJU Int, 2007,100(2)： 414-418.

[8] Liu X, Zhao Y, Pawlyk B, et al. Failure of elastic fiber homeostasis leads to pelvic floor disorders[J]. Am J Pathol, 2006,168(2)： 519-528.

[9] Gabriel B, Watermann D, Hancke K, et al. Increased expression of matrix metalloproteinase 2 in uterosacral ligaments is associated with pelvic organ prolapse[J]. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct, 2006,17(5)： 478-482.

[10] Usta A, Guzin K, Kanter M, et al. Expression of matrix metalloproteinase-1 in round ligament and uterosacral ligament tissue from women with pelvic organ prolapse[J]. J Mol Histol, 2014,45(3)： 275-281.

[11] Wu JM, Visco AG, Grass EA, et al. Matrix metalloproteinase-9 genetic polymorphisms and the risk for advanced pelvic organ prolapse[J]. Obstet Gynecol, 2012, 120(3)： 587-593.

[12] 周慧娟，李懷芳.膠原代謝與盆腔臟器脫垂的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版，2011,32(5),109-113.

Effect of lentivirus-mediated LOX RNA interference on expression of elastin and matrix metalloproteinase-2 in human vaginal wall fibroblasts

DONGXiao-yan1,ZHANGRong1,CHENXin-liang2

(1. Dept.of Obstetrics and Gynecology, Karamay Central Hospital, Karamay 834000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2. Dept.of Gynecology, the International Peace Maternity and Child Health Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030, China)

Objective To investigate the effect of lentivirus-mediated lysine oxidase (LOX) RNA interference on expression of elastic protein and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in human vaginal wall fibroblasts. Methods Anterior vaginal tissue samples were collected from healthy women before and after menopause, the fibroblasts were isolated from vagina tissue by enzymes digestion. The cultured cells were identified using immunofluorescence method. Four lentivirus RNAi vectors of LOX (LOX-RNAi-LV) were constructed and transfected to HEK-293T cells to screening the most efficient LOX-RNAi-LV. The screened LOX-RNAi-LV was transfected to human vaginal tissue-derived fibroblasts cells. The mRNA expression of elastin and MMP-2 was detected by RT-PCR. Results The LOX-RNAi-LV with high efficiency was successfully constructed and transfected to fibroblasts isolated from anterior vaginal wall. The mRNA expression of elastin was decreased and MMP-2 was increased, compared to those before transfection. Conclusion Results indicate that LOX may have a regulatory effect on the expression of elastin and matrix metalloproteinase 2 in fibroblasts of vagina tissue, and may be involved in pelvic organ prolapse.

lysyl oxidase; pelvic organ prolapse; RNAi; Lentiviral vector; elastin; matrix metalloproteinase 2

10.16118/j.1008-0392.2016.04.004

2016-01-16

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目( 81571419)

董曉燕(1967—)，女，副主任醫(yī)師，學(xué)士.E-mail： klmydong@qq.com

陳信良.E-mail： superstarcxl@126.com

R 711.2

A

1008-0392(2016)04-0019-06