伏桂香， 陳尼維， 趙祥運， 范慧寧

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200233)

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外源性硫化氫對三硝基苯磺酸誘導的大鼠腸壁纖維化的影響

伏桂香， 陳尼維， 趙祥運， 范慧寧

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200233)

目的 探討外源性硫化氫對三硝基苯磺酸(trinitrobenzene-sulfonic acid， TNBS)誘導的大鼠慢性結(jié)腸炎腸壁纖維化的影響。方法 健康雌性SD大鼠60只，隨機分為乙醇對照組、模型組、低劑量硫氫化鈉(NaHS)組、高劑量NaHS組(15只/組)，后三組建立TNBS誘導的慢性結(jié)腸炎腸壁纖維化模型。實驗第3周開始，低劑量NaHS組、高劑量NaHS組分別給予腹腔注射H2S供體NaHS[14.4μmol/(kg·d)或36.0μmol/(kg·d)]，對照組和模型組予同等體積的生理鹽水腹腔注射，實驗期間觀察各組大鼠每日的一般情況，第35天處死全部大鼠，采用去蛋白法測血清中的H2S含量，分離結(jié)腸行大體形態(tài)學評分、組織學評分、計算膠原面積百分比，RT-PCR法測定胱硫醚-β-合酶(CBS)mRNA，ELISA法測COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α。結(jié)果 NaHS組H2S含量、CBSmRNA高于模型組，高劑量NaHS組高于低劑量NaHS組；NaHS組大體形態(tài)學評分、組織學評分、膠原面積百分比、COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α低于模型組，高劑量NaHS組低于低劑量NaHS組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 在TNBS誘導的大鼠慢性結(jié)腸炎腸壁纖維化模型中，外源性硫化氫可以使結(jié)腸組織CBSmRNA表達增加，同時具有抗炎、抑制腸壁纖維化的作用，且與劑量呈正相關(guān)。

硫化氫； 慢性結(jié)腸炎； 腸壁纖維化； 大鼠

近年來，研究發(fā)現(xiàn)硫化氫(H2S)參與了體內(nèi)多種生理和病理生理過程，是繼NO和CO之后的第三種氣態(tài)信號分子，廣泛存在于神經(jīng)、心血管、泌尿、呼吸、消化等系統(tǒng)。H2S易溶于水，在體內(nèi)主要以HS-形式存在，可以通過單純擴散的方式穿過細胞膜。H2S具有抗炎、抗纖維化的作用，在肝、腎、肺的組織纖維化中起重要作用，可以預防、緩解組織纖維化的發(fā)生。炎癥性腸病近年來的發(fā)病率有明顯上升趨勢，腸壁纖維化是其常見并發(fā)癥，易導致腸腔狹窄、腸梗阻或瘺，影響腸道功能。本研究通過多次TNBS灌腸誘導大鼠慢性結(jié)腸炎腸壁纖維化模型，反復腹腔注射不同劑量的H2S供體NaHS進行干預，探討外源性H2S在腸壁纖維化中的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，適應性飼養(yǎng)3d，自由取食和飲水，明暗交替12h∶12h。隨機分為乙醇對照組、模型組、低劑量NaHS組、高劑量NaHS組，每組15只。

1.2 主要試劑

NaHS、TNBS、醋酸鋅、對苯二胺鹽酸鹽、三氯化鐵、三氯乙酸、氫硫酸、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自美國Sigma公司，COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-αELISA試劑盒購自杭州優(yōu)爾生物科技有限公司，SYBR Green qPCR SuperMix購自美國Invitrogen公司,PCR引物由上海貴基醫(yī)藥科技有限公司設計、合成。引物序列如下。CBS上游引物： 5′-GCCATTGACCTGCTAAACTT-3′，下游引物： 5′-GCTACTCGGACATAGAGGAT-3′；β-actin上游引物： 5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物： 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。

1.3 方法

1.3.1 動物造模和干預 禁食不禁飲24h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，模型組和NaHS組分別于實驗周期的第1、8、15、22、29天將直徑2mm的硅膠管從肛門插入大鼠腸道約8cm，分別給予10、15、20、25、30mg TNBS+50%乙醇混合液1ml灌腸,乙醇對照組給予同體積50%乙醇灌腸，將大鼠倒置1min。NaHS組于第15天開始分別給予腹腔注射NaHS溶液，劑量分別為： 14.4μmol/kg、36.0μmol/kg,每日1次[1]，乙醇對照組和模型組予同等體積的生理鹽水腹腔注射。實驗動物于第35天全部處死。

1.3.2 結(jié)腸炎癥及纖維化評估 觀察各組大鼠每日的活動、進食、大便形狀、體質(zhì)量的變化。分離全結(jié)腸，參照Butzner等[2]的方法行大體形態(tài)學評分。取距肛門3cm處結(jié)腸組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，H-E染色[3]。進行組織學評分，并行Masson染色，數(shù)字成像，隨機選取5個互不重疊的視野，利用圖像分析軟件計算藍染區(qū)占整個切片總面積的百分比，取其平均值。

1.3.3 結(jié)腸COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量的測定 取病變結(jié)腸組織制備組織勻漿，4℃，離心半徑16cm 14000r/min，離心15min，收集上清液，參照ELISA試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標準曲線分別計算COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量。

1.3.4 結(jié)腸CBSmRNA表達的測定 制備病變結(jié)腸組織勻漿，提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行Real-Time PCR。反轉(zhuǎn)錄反應體系： RNA樣本1μg,H2O 12μl,Oligo dT 0.5μl,反轉(zhuǎn)錄引物0.5μl，dNTPs 2.0μl,RNase抑制劑0.5μl，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl,反轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl，總體積20μl；反應條件： 30℃ 10min,42℃ 60min,85℃ 10min，滅活MMLV。RT-PCR反應體系： cDNA(1∶20)5.0μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl，2×SYBR Green qPCR Super mix 10μl，dH2O 4.0μl，總體積20μl；反應條件： 50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 32s,40個循環(huán)。

1.3.5 血漿H2S含量的測定 處死大鼠前于心臟穿刺采血0.5～1ml注入含肝素抗凝的密封真空采血管中，靜置2h，離心半徑16cm，3000r/min，低溫離心10min，分離血漿，采用去蛋白法測定H2S含量。在試管中加入醋酸鋅0.5ml(10g/L)，0.1ml血漿標本，振蕩均勻，加入0.5ml對苯二銨鹽酸鹽(20mmol/L)以及0.4ml三氯化鐵(30mmol/L)，在室溫下放置約20min，再加入1ml三氯乙酸(100g/L)，去離子水定容至2.5ml，充分混勻，離心半徑16cm，12000r/min，離心5min，吸取上清液，使用分光光度計在670nm處測定吸光度值(D670)。根據(jù)H2S標準曲線計算出H2S水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸炎癥程度

模型組、NaHS組大鼠在第1次TNBS造模當天即出現(xiàn)稀便，且便中有時帶血絲，少動，好睡，精神不佳，食量明顯減少，體質(zhì)量減輕，且癥狀會一直持續(xù)到第2次給藥前。第2次給藥后，癥狀會有所加重，但恢復比第1次給藥快。與前2次比較，第3、4、5次灌腸癥狀較輕，恢復較快。乙醇對照組大鼠也出現(xiàn)上述癥狀，但較之癥狀輕，恢復快。灌腸后第2～ 3天癥狀最為嚴重，以后逐漸緩解。乙醇對照組、模型組、低劑量NaHS組、高劑量NaHS組各死亡2、5、3、3只大鼠。

實驗第35天處死全部大鼠，分離全結(jié)腸。模型組大鼠盲腸明顯膨大，直腸充血、易斷、厚薄不均，可見明顯的血塊，且與周圍組織粘連。NaHS組比模型組病變輕，但同樣存在易斷、粘連、充血等。乙醇對照組以上現(xiàn)象不明顯。行大體形態(tài)學評分，模型組顯著高于乙醇對照組、NaHS組，高劑量NaHS組低于低劑量NaHS組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 組織病理學評分和膠原面積評估

光學顯微鏡下，模型組結(jié)腸組織全層可見炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生明顯。NaHS組組織病理評分顯著低于模型組，高劑量NaHS組明顯低于低劑量組。模型組、NaHS組行Masson染色可見黏膜層、黏膜下層、肌層均有膠原蛋白沉積，黏膜下層尤為明顯。模型組膠原沉積最為嚴重，腸壁全層均見累及。分析顯示，模型組膠原面積顯著高于其余各組，高劑量NaHS組低于低劑量NaHS組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組大體形態(tài)學評分、組織學評分和膠原面積百分比的比較

組別n大體形態(tài)學評分/分組織學評分/分膠原面積百分比/%乙醇對照組130.33±0.121.75±0.5019.54±5.25模型組104.50±0.55*7.00±1.41*48.49±4.27*低劑量NaHS組123.40±1.03*#4.50±1.29*#34.72±4.79*#高劑量NaHS組122.00±0.63*#△2.80±0.50*#△27.31±2.15*#△

與對照組比，*P<0.05;與模型組比，#P<0.05；與低劑量NaHS組比，△P<0.05

2.3 結(jié)腸組織COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量

模型組、NaHS組COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量顯著高于對照組，NaHS組顯著低于模型組，高劑量NaHS組低于低劑量NaHS組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 結(jié)腸CBSmRNA表達和血漿H2S含量

模型組結(jié)腸組織CBSmRNA表達水平及血漿H2S含量顯著低于對照組、NaHS組，高劑量NaHS組高于低劑量NaHS組，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織H-E染色及Masson染色圖片F(xiàn)ig.1 Colonic pathological section of different groups(×100)

表2 組織COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量

組別nCOLIα2/(ng·g-1)COLⅢ/(ng·g-1)TGF-β1/(pg·g-1)TNF-α/(pg·g-1)乙醇對照組132.45±0.665.50±0.6726.80±6.1623.56±4.26模型組104.88±1.13*12.26±2.12*59.59±6.34*51.66±6.84*低劑量NaHS組123.76±0.64*#8.50±1.35*#38.72±5.44*#36.99±5.03*#高劑量NaHS組123.13±0.39*#△6.78±1.29*#△33.04±4.21*#△29.53±3.08*#△

與對照組比，*P<0.05;與模型組比，#P<0.05；與低劑量NaHS組比，△P<0.05

表3 結(jié)腸CBSmRNA表達和血漿H2S含量

組別nCBSmRNAH2S含量/(μmol·L-1)乙醇對照組1383.49±0.1636.58±6.45模型組1017.45±0.04*10.19±0.29*低劑量NaHS組1227.86±0.07*#15.53±0.68*#高劑量NaHS組1248.52±0.05*#△20.74±2.76*#△

與對照組比，*P<0.05;與模型組比，#P<0.05；與低劑量NaHS組比，△P<0.05

3 討 論

H2S是近年來發(fā)現(xiàn)的一種氣態(tài)信號分子，在人類和動物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等發(fā)揮著重要的生理及病理作用。在哺乳動物體內(nèi)，H2S主要有兩種來源： 一種是酶依賴途徑，即依賴5′- 磷酸吡哆醛的胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫 醚-γ-裂解酶(CSE)及非依賴5′-磷酸吡哆醛的3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)途徑，另一種是由腸道的脫硫細菌產(chǎn)生，前者是內(nèi)源性H2S的主要來源，后者則是腸腔H2S的主要來源。H2S的氧化代謝主要在肝臟和結(jié)腸上皮細胞線粒體內(nèi)進行，這一過程需要消耗O2，少部分通過排氣的方式排出體外。胃腸道黏膜主要以CSE、CBS為主，CSE主要分布于胃、十二指腸、空腸，CBS主要分布于回腸、結(jié)腸[4]，H2S既可以通過抗炎、促進HCO-3分泌、增加血流發(fā)揮黏膜保護作用，又可以通過鉀離子通道、鈣離子通道等調(diào)節(jié)胃腸道的蠕動。既往的研究證實內(nèi)源性H2S與潰瘍性結(jié)腸炎、急性胰腺炎、肝纖維化等存在相關(guān)性，具有抗炎、抗纖維化的作用[5-6]。腸壁纖維化是炎癥性腸病的常見并發(fā)癥，易導致腸腔狹窄，甚至腸梗阻及瘺，需手術(shù)干預且復發(fā)率較高。本研究結(jié)果顯示，模型組及NaHS組在癥狀持續(xù)時間、嚴重程度上均較乙醇對照組嚴重；模型組的大體形態(tài)學評分、組織病理學評分、膠原面積百分比、COLIα2、COLⅢ、TGF-β1、TNF-α含量顯著高于乙醇對照組、NaHS組，高劑量NaHS組低于低劑量NaHS組；模型組CBSmRNA表達水平、H2S含量較乙醇對照組、NaHS組顯著降低，高劑量NaHS組高于低劑量NaHS組(P<0.05)?？梢酝茢?，在TNBS誘導的大鼠腸壁纖維化模型中，外源性H2S可以通過影響TGF-β、TNF-α炎性因子的表達，參與膠原蛋白的合成與降解，發(fā)揮其抗炎、抗纖維化的作用，明顯改善腸壁纖維化的發(fā)生發(fā)展。

腸壁纖維化是由于細胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡，膠原蛋白過度沉積所致。ECM的合成與降解是由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)共同調(diào)控。IL-10、IL-13、IGF-I、TGF-β等炎性因子通過調(diào)控細胞內(nèi)的MMPs和TIMPs的表達影響ECM的產(chǎn)生與降解[7-10]。另外，氧化應激[11]、遺傳因素[12]、腸道微生物[13]等也通過各種途徑影響ECM的降解，參與腸壁纖維化的發(fā)生發(fā)展。Schwer等[14]對胰腺星狀細胞(PSC)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，H2S可以抑制血紅素加氧酶-1(HO-1)介導的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)表達，抑制PSC的增殖和遷移，從而影響ECM的合成。吳林等[1]發(fā)現(xiàn)外源性H2S可以通過減少膠原蛋白的合成，下調(diào)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2及Bax的表達，延緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生。外源性H2S在肝纖維化、肺纖維化、腎間質(zhì)纖維化模型中具有抗炎、抗纖維化的作用，本研究同樣發(fā)現(xiàn)外源性H2S在腸壁纖維化中的抗炎、抗纖維化作用，其作用機制可能與調(diào)控TGF-β1、TNF-α等炎性因子的表達，直接或間接影響ECM的合成及降解有關(guān)。但是外源性H2S在人類慢性結(jié)腸炎腸壁纖維化中是否具有保護作用仍需進一步研究證實。

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Effect of exogenous hydrogen sulphide on intestinal fibrosis induced by trinitrobenzene-sulfonic acid in rats

FUGui-xiang,CHENNi-wei，ZHAOXiang-yun,FANHui-ning

(Dept.of Gastroenterology, Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China)

Objective To investigate the effect of exogenous hydrogen sulphide on chronic colitis and intestinal fibrosis induced by trinitrobenzene-sulfonic acid(TNBS)in rats. Methods Sixty healthy femal Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups： alcohol-control group, model group, low-dose NaHS and hige-dose NaHS group. Intestinal fibrosis were induced by TNBS in model group, low-dose and hige-dose NaHS groups. At the beginning of the third week, rats in NaHS groups were injected intraperitoneally once a day with NaHS(14.4μmol/kg and 36.0μmol/kg,respectively)starting from the 3rd week, an equal volume of normal saline was injected in the alcohol-control and model groups. All rats were sacrificed at the end of the 5th week. Serum H2S level was measured； colons samples were collected for pathological examination and measurement of collagen area, the expression of CBS mRNA was determined by RT-PCR, COLIα2, COLⅢ, TGF-β1, TNF-α were detected by ELISA. Results The macroscopic and microscopic scores， collagen area， the level of COLIα2、 COLⅢ、TGF-β1、TNF-α were higher in model group than in NaHS groups, while these in high-dose NaHS group were significantly lower than in low-dose NaHS group(P<0.05). The level of serum H2S and CBS mRNA were significantly higher in NaHS groups than those in model group(P<0.05), and these parameters were higher in hige-dose NaHS group than those in low-dose NaHS group(P<0.05). Conclusion Results indicate that exogenous hydrogen sulphide has anti-inflammatory and anti-fibrotic effects in a dose-dependent manner in rats with chronic colitis and intestinal fibrosis induced by TNBS.

hydrogen sulphide; chronic colitis; intestinal fibrosis; rat

10.16118/j.1008-0392.2016.04.002

2016-03-28

伏桂香(1989—)，女，碩士研究生.E-mail： 6546345@163.com

陳尼維.E-mail： chenniwei@163.com

R 516.1

A

1008-0392(2016)04-0007-05