唐倫先， 許明正， 張 穎， 劉顯東, 張 華

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200120)

?

·基礎(chǔ)研究·

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在慢性心力衰竭中的作用及n-3PUFA的保護(hù)機(jī)制

唐倫先1， 許明正1， 張 穎1， 劉顯東1, 張 華2

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200120； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 200120)

目的 觀察線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore， MPTP)在慢性心力衰竭模型中的作用，并初步探討n-3PUFA的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。方法 采用阿霉素腹腔注射Wistar大鼠建立心力衰竭模型。正常對照組10只，青年和老年心力衰竭組各20只(安慰劑組和n-3PUFA組各10只)。進(jìn)行超聲心動圖心功能檢測和心肌病理組織學(xué)檢查；ELISA法檢測各組大鼠血清中BNP的表達(dá)；提取心肌線粒體，檢測膜電位和MPTP孔活性；TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；免疫組化法檢測各組大鼠左心室心肌細(xì)胞Cleaved-Caspase3的表達(dá)。結(jié)果 n-3PUFA治療組與安慰劑組相比，各項(xiàng)心功能指標(biāo)均明顯改善，LVEDD和LVESD明顯降低，LVEF及LVFS明顯升高(P<0.05)，而且心肌損害明顯減輕，血清BNP明顯降低(P<0.05)。心力衰竭組與對照組相比，心肌線粒體膜電位降低，MPTP孔活性增加，通透性增強(qiáng)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，心肌Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。n-3PUFA治療組與安慰劑組相比，心肌線粒體膜電位增加，MPTP孔活性降低，通透性降低，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，心肌Cleaved-Caspase3表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 n-3PUFA可能通過抑制心肌線粒體MPTP孔活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，有效改善年心力衰竭模型的心功能。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔； 慢性心力衰竭； n-3多不飽和脂肪酸； Caspase-3蛋白； 大鼠

線粒體在心肌細(xì)胞存亡過程中起著非常重要的作用，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permea-bility transition pore， MPTP)的開放導(dǎo)致線粒體腫脹、膜電位的崩解、呼吸鏈的脫耦聯(lián)、細(xì)胞色素C(cytochrome C)及其他致凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[1]。研究提示MPTP可能在慢性心力衰竭，特別是老年慢性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acid, n-3PUFA)可通過改善線粒體功能和增加ATP的合成而發(fā)揮心血管的保護(hù)作用[2]，但目前尚未有n-3PUFA作用于心力衰竭心肌MPTP的報(bào)道。既往研究提示，與青年大鼠相比，MPTP孔在老年大鼠慢性心力衰竭模型中可能起了重要作用，本研究擬通過建立慢性心力衰竭大鼠模型，評價(jià)和比較MPTP在青年和老年慢性心力衰竭模型的作用及n-3PUFA的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠各15只(合格證號： SYXK 2013-1-0003)，健康月齡分別為3個(gè)月(青年，體質(zhì)量200～250g)與12個(gè)月(老年，體質(zhì)量450～500g)，清潔級，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

注射用鹽酸多柔米星(阿霉素)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號33021980；n-3PUFA購自美國Sigma-Aldrich公司；原位凋亡檢測試劑盒(POD法)購自Roche公司(貨號11684817910)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，產(chǎn)品編號C2006)、純化線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測試劑盒(產(chǎn)品編號GMS10095.2)購自碧云天生物技術(shù)研究所。大鼠BNP ELISA試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。熒光分光光度計(jì)為日立公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡和圖像處理系統(tǒng)為尼康公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡為奧林巴斯產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 CHF組參照文獻(xiàn)[3]建模，即腹腔注射鹽酸阿霉素(2mg/kg)，每周1次，連續(xù)8周。8周后行心臟超聲檢查以及血流動力學(xué)監(jiān)測，以心腔擴(kuò)張，射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)<60%為標(biāo)準(zhǔn)，入選心力衰竭組。各組均正常飲食喂養(yǎng)，觀察大鼠的活動量、飲食量、尿量變化和精神狀態(tài)。

1.3.2 動物分組及給藥 青年組和老年組各15只。每組又分為正常對照組(n=5)、安慰劑組(n=5)和n-3PUFA組(n=5)。均統(tǒng)一飼養(yǎng)，黑夜、白晝各12h。參照文獻(xiàn)[3]的方法，n-3PUFA組從注射鹽酸阿霉素起，每日喂養(yǎng)n-3PUFA 8周，劑量為1mg/kg體質(zhì)量，安慰劑組則每日經(jīng)胃管喂養(yǎng)相同劑量生理鹽水。

1.3.3 心功能測定 苯巴比妥鈉20mg/kg腹腔注射，輕度鎮(zhèn)靜大鼠，使用13MHz線陣探頭于n-3PUFA治療6～8周后分別采集大鼠胸骨旁左心室長軸切面、短軸乳頭肌切面二維動態(tài)圖像，并于短軸切面獲得M型超聲心動圖。調(diào)節(jié)幀頻至224～483幀/s，圖像深度1cm，采集左室多普勒組織速度圖像。測量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter， LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter, LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening, LVFS)。

1.3.4 心肌病理學(xué)觀察 取心尖部組織，用10%甲醛常規(guī)固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4μm，H-E染色，顯微鏡下觀察。

1.3.5 ELISA法測定BNP的表達(dá) 處死大鼠，心臟直接取血，離心半徑14cm，3000r/min，離心5min，上清液凍存于-80℃冰箱，ELISA法分別測定BNP的表達(dá)。

1.3.6 心肌細(xì)胞凋亡檢測 處死大鼠，取不同組左心室組織約200g，以4%甲醛固定隔夜，乙醇梯度脫水，石蠟包埋并切片，標(biāo)本行TUNEL染色，棕色為TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為被蘇木精染色的細(xì)胞核。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件分析照片時(shí)，每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)讓組織充滿整個(gè)視野，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性細(xì)胞的比率。凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 心肌線粒體的分離 處死大鼠，取不同組左心室組織約100mg，按照組織線粒體分離試劑盒說明書分離心肌線粒體，加入40μl線粒體儲存液，重懸線粒體。

1.3.8 心肌線粒體膜電位和膜通透性檢測 將20μg總蛋白的線粒體加入JC-1工作液中，熒光分光光度計(jì)測定相應(yīng)的熒光值，以紅光/綠光的比值表示膜電位，比值降低，表明線粒體通透性增加；20μg總蛋白的線粒體按GENMED MPTP熒光檢測試劑盒說明書測定線粒體MPTP，使用分光光度計(jì)檢測540nm處線粒體吸光度值(D540)。

1.3.9 免疫組化檢測Cleaved-Caspase3的表達(dá) 嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書步驟操作，抗體工作濃度為1∶50。Cleaved-Caspase3蛋白陽性產(chǎn)物為分布于細(xì)胞質(zhì)的棕黃色顆粒。用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張切片進(jìn)行分析，得出Cleaved-Caspase3蛋白陽性的累積光密度值(IOD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 超聲心動圖心功能檢測和血漿BNP水平比較

青年和老年大鼠心力衰竭模型組LVEDD、LVESD均明顯高于對照組，而LVEF及LVFS則明顯降低(P<0.05)；n-3PUFA治療組大鼠與心力衰竭安慰劑組相比，各項(xiàng)心功能指標(biāo)均明顯改善，LVEDD和LVESD明顯降低，LVEF及LVFS明顯升高(P值均<0.05)。

無論青年還是老年組，心力衰竭大鼠血漿BNP水平均顯著高于正常對照組，n-3PUFA治療組與心力衰竭模型安慰劑組相比，BNP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組心功能檢測指標(biāo)及BNP的變化

組 別LVEDD/mmLVESD/mmLVEF/%LVFS/%BNP/(pg·ml-1)青年組 正常對照5.03±0.712.09±0.2385.41±7.1065.13±7.510.12±0.04 心力衰竭安慰劑6.78±0.49*3.85±0.47*55.62±4.19*36.73±6.33*0.26±0.07* n-3PUFA5.85±0.43*#2.95±0.25*#67.95±5.23*#48.14±3.89*#0.21±0.06*#老年組 正常對照6.93±0.543.83±0.4871.13±6.5155.62±7.680.13±0.01 心力衰竭安慰劑8.92±0.49*5.42±0.37*48.62±8.21*29.81±7.32*0.29±0.09* n-3PUFA7.15±0.33*#4.45±0.43*#65.95±3.27*#39.05±8.47*#0.18±0.08*#

與對照組相比，*P<0.05；與心力衰竭安慰劑組相比，#P<0.05

2.2 大鼠心肌組織H-E染色觀察

病理學(xué)觀察顯示，青年和老年對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，胞核清晰，可見橫紋，無心肌纖維的破壞，細(xì)胞間隙正常，細(xì)胞大小均一；心力衰竭模型組細(xì)胞則見心肌纖維排列紊亂，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞腫脹，肌原纖維溶解斷裂明顯，并且在心肌纖維間可見結(jié)締組織增生。n-3PUFA組雖也有心肌纖維的輕度變形等損害，但與模型組相比心肌損害明顯減輕，見圖1。

圖1 光鏡下大鼠心肌組織H-E染色圖片F(xiàn)ig.1 Histopathological changes of myocardial tissue in heart failure rats(H-E staining,×100)

2.3 心肌線粒體膜電位和MPTP活性

青年和老年心力衰竭組大鼠心肌線粒體膜電位明顯低于正常對照組，MPTP孔活性增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心力衰竭模型組相比，n-3PUFA治療組大鼠明顯增加線粒體膜電位，降低MPTP孔活性(P<0.05)。老年組正常大鼠MPTP孔活性低于青年組大鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 心肌組織線粒體膜電位和MPTP孔活性

組 別膜電位MPTP孔活性青年組 正常對照1.93±0.381497.75±123.35 心力衰竭安慰劑1.20±0.36*2028.75±245.47* n-3PUFA1.45±0.13*#1658.75±189.75*#老年組 正常對照1.92±0.241335.25±163.48 心力衰竭安慰劑1.05±0.29*1990.00±152.37* n-3PUFA1.44±0.39*#1622.75±201.43*#

與對照組相比，*P<0.05;與心力衰竭安慰劑組相比，#P<0.05

2.4 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

青年和老年對照組僅有少量凋亡細(xì)胞，心力衰竭模型和n-3PUFA組均較對照組凋亡細(xì)胞增多(P<0.05)；與安慰劑心力衰竭組相比，n-3PUFA治療組大鼠心肌凋亡細(xì)胞減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3、圖2。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)

組 別AI/%Cleaved-Caspase3青年組 正常對照1.08±0.2877.75±12.46 心力衰竭安慰劑37.20±8.23*428.61±105.27* n-3PUFA24.75±6.13*#248.05±69.55*#老年組 正常對照1.92±0.3495.25±10.48 心力衰竭安慰劑45.65±6.29*590.00±152.64* n-3PUFA28.44±5.35*#362.68±81.48*#

與對照相比，*P<0.05；與心力衰竭安慰劑組相比，#P<0.05

2.5 大鼠心肌組織Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)

青年和老年各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase3蛋白的陽性表達(dá)為分布于細(xì)胞質(zhì)中的棕黃色顆粒。正常對照組僅見少許Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)，而心力衰竭安慰劑組和n-3PUFA組大鼠心肌細(xì)胞中Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)均明顯增多，顏色明顯加深；與心力衰竭安慰劑組相比，n-3PUFA治療組大鼠心肌細(xì)胞Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖3。

圖2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡Fig.2 The measurement of apoptosis in myocardial tissue by TUNEL(×200)細(xì)胞核棕褐色的為凋亡細(xì)胞

圖3 免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)Fig.3 Immunohistochemical staining of Cleaved-Caspase3 in myocardial tissue in rats of each group(×200)棕黃色顆粒為Cleaved-Caspase3蛋白的陽性表達(dá)產(chǎn)物

3 討 論

研究表明，無論血流動力學(xué)異常、神經(jīng)體液激素過度激活還是瓣膜異常引起的慢性心力衰竭，均伴有線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，因此線粒體的變化可能在心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。

MPTP是位于線粒體內(nèi)、外膜上由多個(gè)蛋白組成的非選擇性、高導(dǎo)電性復(fù)合通道，主要由基質(zhì)的親環(huán)蛋白D(cyclophilin D, CyP-D)、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenine nucleotide translocator, ANT)以及內(nèi)膜的線粒體磷酸轉(zhuǎn)載體(phosphatecarrier, PiC)三個(gè)基本亞基組成[5]，在心肌細(xì)胞凋亡、心肌缺血/再灌注損傷中具有重要作用。心臟衰老使心臟對心肌缺血、收縮壓升高等病理狀況更為敏感。既往研究提示，隨年齡增長，大鼠心肌線粒體PT孔開放增加，線粒體膜電位降低、線粒體呼吸功能抑制、心功能出現(xiàn)明顯衰退[6]。本研究通過阿霉素誘導(dǎo)建立青年和老年大鼠慢性心力衰竭模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，心力衰竭大鼠線粒體膜電位明顯降低，MPTP孔活性增加，這與既往研究一致。

心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭心肌重構(gòu)的過程中起著重要作用，線粒體途徑是非常重要的通路系統(tǒng)，起著中心調(diào)控的作用。Caspase-3蛋白是各種凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在線粒體途徑誘導(dǎo)的凋亡中也起著非常重要的作用[7]。研究表明，在凋亡刺激因素的作用下，MPTP孔徑明顯增加，外膜破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)入胞質(zhì)，與Caspase-9前體、d-ATP和凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)組成凋亡復(fù)合體，活化Caspase-9并激活下游的Caspase-3蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)功能障礙，激活細(xì)胞核內(nèi)切酶，使DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。本研究證明，無論老年還是青年心力衰竭大鼠心肌凋亡細(xì)胞明顯增多，并伴隨Cleaved-Caspase3蛋白水平增加。

n-3 PUFA是一類人體必需脂肪酸，它主要包括EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)、ALA(十八碳三烯酸)等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFA可以阻止心力衰竭的進(jìn)展[10]。MPTP的開放受線粒體膜上的磷脂成分所影響，尤其是花生四烯酸和心磷脂(cardiolipin, CL)[11]。CL起著維持正常線粒體的呼吸功能的作用，心力衰竭時(shí)CL水平下降[12]。Karen等[13]通過冠狀動脈結(jié)扎建立心肌梗死模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充n-3PUFA延遲假手術(shù)組大鼠Ca2+誘導(dǎo)的心肌線粒體MPTP開放，而這種效應(yīng)在添加環(huán)孢素A后得到增強(qiáng)，并且不伴隨線粒體呼吸功能、耦聯(lián)功能改善和CyP-D蛋白的增加。Ramzi等[14]通過腹主動脈縮窄法建立心肌肥厚模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充EPA+DHA延遲正常和心肌肥厚大鼠Ca2+誘導(dǎo)的心肌線粒體MPTP開放。

目前對線粒體保護(hù)在心力衰竭的研究還較少，還沒有明確的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)抑制MPTP對心力衰竭尤其是老年心力衰竭的療效，環(huán)孢霉素A雖然是公認(rèn)的MPTP抑制劑，但由于其巨大的副作用限制了臨床的推廣應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)n-3PUFA能夠抑制MPTP孔開放，降低膜電位，改善線粒體功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，降低活化Caspase-3的表達(dá)，為針對MPTP靶點(diǎn)防治老年心力衰竭提供了一個(gè)新的方向，但其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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The role of mitochondrial permeability transition pore in chronic heart failure rats and potential protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acid

TANGLun-xian1,XUMing-zheng1,ZHANGYin1,LIUXian-dong1,ZHANGHua2

(1. Dept. of Emergency Internal Medicine，East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China；2. Dept. of Geriatric， East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the role of mitochondrial permeability transition pore in chronic heart failure rats and potential protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acid. Methods Thirty Wistar rats were divided into 3groups： the control group(n=10); heart failure(HF)+placebo group(n=10); heart failure(HF)+n-3PUFA group(n=10). HF groups received intraperitoneal injection of doxorubicin 2mg/kg every week. The n-3PUFA group was treated with n-3PUFA by gavage daily for 8 weeks. Echocardiography and histological examination were performed in 3 groups. The concentration of BNP in the serum was measured by ELISA. The mitochondrial membrane potential and MPTP activity were measured by relevant kits. Apoptotic index (AI) was detected by TUNEL assay. The expression of Cleaved-Caspase3 was evaluated by immunohistochemistry. Results Compared with the HF placebo group, the echocardiography parameters and histological damage of n-3PUFA group were attenuated. Compared with the control group, BNP in the serum of HF group were elevated (P<0.05). The mitochondrial membrane potential in the HF+placebo group was significantly lower than the control groups, while the MPTP activity was significantly elevated(P<0.05).Compared with the HF+placebo group, the mitochondrial membrane potential was significantly increased, the MPTP activity was significantly decreased, the apoptotic index and the expression of Cleaved-Caspase3 were significantly reduced in N-3 PUFA group(allP<0.05). Conclusion n-3PUFA can decrease the MPTP activity, inhibit the myocardial apoptosis in chronic heart failure rats, which might be the potential mechanism of protective effects.

MPTP; chronic heart failure; n-3 polyunsaturated fatty acid; Caspase-3; rat

10.16118/j.1008-0392.2016.04.001

2015-12-02

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展創(chuàng)新基金(PKJ2012-Y09; PKJ2012-Y64)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)計(jì)委優(yōu)秀學(xué)科帶頭人附帶課題(PWRd2014-08)

唐倫先(1977—)，女，副主任醫(yī)師，博士.E-mail： 456tlx@163.com

張 華.E-mail： zhanghuazh@medmail.com.cn

R 541

A

1008-0392(2016)04-0001-06