任吉野，秦虹，任吉祥

(1.松原市前郭縣中醫(yī)院，神經(jīng)內(nèi)科 吉林 松原 138000；2.長春市中醫(yī)院 心電超聲科， 吉林 長春 130022；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腦病科，吉林 長春 130021)

GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的影響

任吉野1，秦虹2，任吉祥3Δ

(1.松原市前郭縣中醫(yī)院，神經(jīng)內(nèi)科 吉林 松原 138000；2.長春市中醫(yī)院 心電超聲科， 吉林 長春 130022；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 腦病科，吉林 長春 130021)

目的 探討GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的影響。方法 C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用不同濃度GTA/AVC雙重抑制劑(1 000、1 500、2 000 μg/mL)處理不同時(shí)間(12、48、72 h)，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。結(jié)果 GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并在48 h作用最為明顯。GTA/AVC雙重抑制劑(2 000 μg/mL)能顯著升高G0/G1期細(xì)胞的比率，降低S期細(xì)胞比率；細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組及GTA/AVC雙重抑制劑 (1 000 μL/mL) 治療組 (P<0.05)。結(jié)論 GTA/AVC雙重抑制劑可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞生長作用。

GTA/AVC雙重抑制劑；C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的80%，預(yù)后差且易復(fù)發(fā)[1]。目前國內(nèi)外對于該病的治療仍以手術(shù)和放、化療相結(jié)合為主，由于腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長，手術(shù)很難徹底切除，術(shù)后極易復(fù)發(fā)；而放、化療對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺乏特異性；大多數(shù)化療藥物不僅易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)會對人體的正常組織產(chǎn)生不良的影響[2]。迄今為止，國內(nèi)外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價(jià)格昂貴且不良反應(yīng)大。同時(shí)也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制[3-5]，隨著醫(yī)學(xué)實(shí)踐不斷發(fā)展及探索發(fā)現(xiàn)許多生物活性肽對抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有良好的功效，且具有選擇性高、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。為此，尋找高效、低毒、價(jià)廉并對人體損傷較小的抗腫瘤活性肽治療的藥物成為近年來研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用的GTA/AVC雙重抑制劑為本研究室設(shè)計(jì)并合成，研究其對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的影響，并通過檢測對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期等變化，初步探討其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能作用的機(jī)制，為進(jìn)一步研究在臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、主要試劑及藥品:腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

細(xì)胞周期檢測試劑盒(產(chǎn)品編號：C1052) 由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；二甲基亞砜 、四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT) 均為 美國Sigma 公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，批號：TBD31HB)；GTA/AVC雙重抑制劑，由上海吉爾公司合成，純度為98%；卡莫司汀購自天津金耀藥業(yè)有限公司(批號：1407011)。

1.1.2 主要儀器：NiKon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本尼康公司)；NCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱 (日本三樣電機(jī)株式會社；BSC-BOOⅡB2 AN YANG 超凈臺 (蘇州安洋科技發(fā)展有限公司；guava easyCyte 6HT-2L流式細(xì)胞儀(默克密理博中國)；MODEL550型酶標(biāo)儀(上海BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞存活率：取對數(shù)生長期C6細(xì)胞，加入0.25% 胰酶2 mL消化；用PBS終止消化；離心，1 500 r/min，5 min； 棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度為1×104/mL； 細(xì)胞接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，終體積200 μL；待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為空白對照組、卡莫司汀組及不同濃度GTA/AVC雙重抑制劑1 000、1 500、2 000 μg/mL組，20 μL/每孔，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組分別設(shè)8個(gè)復(fù)孔。置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，分別孵育24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT孵育4 h，以DMSO每孔150 μL終止反應(yīng)。將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長測定吸光度(A)值，以空白對照孔A值調(diào)零，記錄結(jié)果。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后，收集細(xì)胞，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液， 將細(xì)胞輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞，離心，PBS洗2次，用500 μLPBS從懸細(xì)胞，每離心管中加入(各100 μL 1 mg/mL PI、10 mg/mL RNaseA、0.01%TritonX-100)，37 ℃避光染色30 min。采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期變化，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以各個(gè)細(xì)胞周期所占的百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞活性 結(jié)果顯示，不同劑量GTA/AVC雙重抑制劑作用C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在24h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形。各實(shí)驗(yàn)組之間抑制的作用也無顯著性差異。在48 h時(shí)，GTA/AVC雙重抑制劑對C6細(xì)胞具有明顯的抑制作用，空白對照組略呈旋渦狀生長，GTA/AVC雙重抑制劑 2 000 μg/mL 組與正常對照組及1 000 μg/mL組比較具有顯著性差異(P<0.05)；在72 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長均加快，均呈現(xiàn)旋渦狀生長。其中，卡莫司汀組和GTA/AVC雙重抑制劑組的細(xì)胞生長較空白對照組細(xì)胞生長略微緩慢。提示，細(xì)胞生長 72 h， GTA/AVC雙重抑制劑對C6細(xì)胞生長無抑制作用。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 GTA/AVC雙重抑制劑對C6細(xì)胞活性的影響(20×)Fig.1 Effects of GTA/GVA double inhibitor on the activity of C6 cells(20×)

組別抑制率(%)24h48h72h正常對照組0 201±0 0340 247±0 0370 250±0 043卡莫司汀組0 194±0 0300 193±0 034?0 221±0 039GTA/AVC雙重抑制劑1000μg/mL0 201±0 0250 231±0 0630 218±0 032GTA/AVC雙重抑制劑1500μg/mL0 199±0 0370 194±0 036?0 212±0 025GTA/AVC雙重抑制劑2000μg/mL0 200±0 0280 183±0 035?#0 215±0 023

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal group；#P<0.05，與1 000 μg/mL組比較，compare with 1000 μg/mL group

2.2 GTA/AVC雙重抑制劑對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期變化的影響 研究顯示，GTA/AVC雙重抑制劑作用48 h能夠引起C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μg/mL組與正常對照組比較及1 000 μL/mL組比較G0/G1期比率明顯升高，S期細(xì)胞數(shù)比率下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與卡莫司汀組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明GTA/AVC雙重抑制可明顯抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)程。見圖2、表2。

圖2 GTA/AVC雙重抑制劑對C6細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effects of GTA/AVG double inhibition on the cell cycle of C6 cells

G0/G1SG2/M正常對照組46 41±8 5749 67±8 943 92±4 00卡莫司汀組62 68±2 9836 23±3 491 08±0 55GTA/AV雙重抑制劑1000μg/mL52 88±2 7144 36±0 342 78±2 63GTA/AV雙重抑制劑1500μg/mL58 82±1 7040 09±2 321 10±0 65GTA/AV雙重抑制劑2000μg/mL67 75±3 27?#28 88±2 32?2 77±2 09

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal group；#P<0.05，與1 000 μg/mL組比較，compared with 1 000 μg/mL group

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差。其發(fā)病率近年來有所升高，且其發(fā)病群體呈現(xiàn)年輕化趨勢[9]。膠質(zhì)瘤對機(jī)體最大的影響是其對腦組織的壓迫癥狀。在臨床膠質(zhì)瘤的治療中，手術(shù)是其首選的治療方法。但手術(shù)并不能徹底清除膠質(zhì)瘤，因膠質(zhì)瘤本身增殖迅速，且侵襲性強(qiáng)，故術(shù)后依然會有部分侵襲到遠(yuǎn)處的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞又會在短期內(nèi)迅速增殖，形成新的膠質(zhì)瘤團(tuán)塊而產(chǎn)生新的壓迫癥狀[10]。因此，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后均要常規(guī)進(jìn)行針對殘留膠質(zhì)瘤細(xì)胞的輔助治療。目前臨床常用的輔助治療措施依然是放、化學(xué)治療，但此2種治療方法因?yàn)楦弊饔么?，患者往往不能耐受[11]。為此，尋找高效、低毒、療效穩(wěn)定的抗腫瘤藥物仍是目前研究開發(fā)的熱點(diǎn)，而多肽藥物恰恰具備了這些優(yōu)點(diǎn)。

腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)程及腫瘤細(xì)胞增殖，已成為腫瘤治療的重要手段之一[12-15]。本實(shí)驗(yàn)選用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡情況，結(jié)果顯示，GTA/AVC雙重抑制劑對C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用，并在48 h作用最為明顯，鏡下可見空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組較空白對照組及GTA/AVC雙重抑制劑 1 000 μL/mL組抑制作用更強(qiáng)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組細(xì)胞生長受到明顯抑制。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特性表現(xiàn)為細(xì)胞的分化與增殖調(diào)控失常[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控異常與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。結(jié)果表明，GTA/AVC雙重抑制劑與卡莫司汀誘導(dǎo)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，均可使G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加；GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與卡莫司汀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GTA/AVC雙重抑制劑2 000 μL/mL組與GTA/AVC雙重抑制劑1 000 μL/mL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，表明進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞減少。因此，推測GTA/AVC雙重抑制劑對C6腫瘤細(xì)胞生長是通過阻滯G0/G1期細(xì)胞，使S期細(xì)胞減少，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這種作用表現(xiàn)為具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。

綜上所述，GTA/AVC雙重抑制劑可能通過阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的合成與復(fù)制，抑制細(xì)胞分裂、降低細(xì)胞增殖能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生成。

[1] Min WJ,Li YN,Zhang YH,et al.Role of the anti-glioma drug AT13148 in the inhibition of Notch signaling pathway[J].Gene,2015,573:153-159.

[2]賈彥召，余杰，饒石磊.惡性腦膠質(zhì)瘤同步放化療中替莫唑胺化療的不良反應(yīng)及對策[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2015，9(1)：127-128.

[3]Okada M,Sato A,Shibuya K.JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression[J].Int J Oncol,2014, 44(2):591-599.

[4]Sze CI,Su WP,Chiang MF,et al.Assessing current therapeutic approaches to decode potential resistance mechanisms in glioblastomas[J].Front Oncol,2013,3:59.

[5]Silber JR, Bobola MS, Blank A, et al. O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase in glioma therapy: promise and problems[J].Biochim Biophys Acta, 2012,1826(1):71-82.

[6]Li J, Cheng YN,Zhang XK,et al.The in vivo immunomodulatory and synergistic anti-tumor activity of thymosin α1-thymopentin fusion peptide and its binding to TLR2[J].Cancer Letters,2013,337(2):273-247.

[7]楊輝，郭春燕.二甲砷基谷光甘肽對腫瘤的治療作用及機(jī)制[J].中國新藥與臨床雜志，2011，30(2)：99-102.

[8]Cong JL, Zhang YF,Durfee J,et al.A heat shock protein 70-based vaccine with enhanced immunogenicity for clinical use[J].J Immunol,2010,184(1):488-496.

[9]Xiong J,Bing Z,Su Y,et al.An integrated mRNA and microRNA expression signature for glioblastoma multiforme prognosis[J]. PLoS One,2014,9(5):e98419.

[10]Fiveash JB, Gillespie GY, Buchsbaum DJ. Enhancement of glioma radiotherapy and chemotherapy response with targeted antibody therapy against death receptor 5[J]. Int J Radiat Oncol,2008,71(2):507-516.

[11]賈彥召，余杰，饒石磊.惡性腦膠質(zhì)瘤同步放化療中替莫唑胺化療的不良反應(yīng)及對策[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2015，9(1)：127-128.

[12]方艷秋，齊亞靈，白曉，等.Survivin反義核苷酸對肝細(xì)胞株SMMC-7721增殖的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，39(2)：278-281.

[13]Cobbs CS.Cytomegalovirus and brain tumor: epidemiology, biology and therapeutic aspects[J]. Curr Opin Oncol ,2013,25(6):682-688.

[14]Dubrez L,Berthelet J,Glorian V. IAP proteins as targets for drug development in oncology [J].Onco Targets Ther ,2013,9:1285-1304.

[15]Bartuzi P,Hofker MH,van de Sluis B.Tuning NF-κB activity: A touch of COMMDD proteins[J].Biochim Biophys Acta,2013,1832(12):2315-2321.

[16]叢文銘.DNA 含量定量分析在腫瘤病理學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志，1989，18(3)：235-237.

(編校：吳茜)

Effect of GTA/AVC double inhibitors on C6 brain nerve glima cells

REN Ji-ye1, QIN Hong2, REN Ji-xiang3Δ

(1.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Qian Guo County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Songyuan 138000; China; 2.Department of Electrocardio-ultrasound, Changchun City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130021, China; 3.Department of Encephalopaty,Affiliated Hospital of Changchun University of Tradtional Chinese Medicine, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo study the effect of GTA/AVC dual inhibitors on C6 brain nerve glima cells. MethodsMTT method was used to test the brain glioma cells activity of proliferation at different times(12 h,48 h,72 h), and using the flow cytometry to detect the change of cells cycle. ResultsIt has obvious inhibitory effcets on C6 brain nerve glima cells, and it was the most obvious at 48 h. GTA/AVC dual inhibitor(2000 μg/mL)treatment group remarkbly rise the G0/G1 rate of celluar, S-phase cell ratio descend,and the cells apoptosis rate was markedly increased.Compared with the control group and the GTA/AVC dual inhibition (1000 μL/mL)treatment group , were significant difference(P<0.05).Conclusionregulating cells cycle progression.

GTA/GVA double inhibitor; C6 brain nerve glima cells; flow cytometry

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.008

任吉野，男，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)，E-mail：renjy1980@163.com；任吉祥，通信作者，男，副教授，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科腦病，E-mail：renjx@163.com。

R739.4

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