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        TGF-β3對PLGA支架3-D培養(yǎng)兔髓核細胞影響的體外研究

        2016-07-10 10:27:44辛龍徐衛(wèi)星俞雷鈞宋洪浦范順武王振斌
        中國生化藥物雜志 2016年9期
        關鍵詞:支架

        辛龍,徐衛(wèi)星,俞雷鈞,宋洪浦,范順武,王振斌

        (1.浙江省立同德醫(yī)院 骨科,浙江 杭州 310012;2.浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院 骨科,浙江 杭州 310016; 3.新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院 骨科,新疆 烏魯木齊 830002)

        TGF-β3對PLGA支架3-D培養(yǎng)兔髓核細胞影響的體外研究

        辛龍1,徐衛(wèi)星1,俞雷鈞1,宋洪浦1,范順武2,王振斌3Δ

        (1.浙江省立同德醫(yī)院 骨科,浙江 杭州 310012;2.浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院 骨科,浙江 杭州 310016; 3.新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院 骨科,新疆 烏魯木齊 830002)

        目的 評價轉化生長因子β3(transforming growth factor-β,TGF-β3)對兔髓核細胞在聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)支架3-D培養(yǎng)的影響。方法 應用粒子瀝濾法制備多孔PLGA支架培養(yǎng)兔髓核細胞(1×106/PLGA),分為100 ng/mL TGF-β3/PLGA,500 ng/mL TGF-β3/PLGA,1 μg/mL TGF-β3/PLGA,PLGA對照組。通過MTT分析細胞增殖分化,1,9-二甲基亞甲藍(DMMB)法檢測糖胺多糖(GAG),qPCR檢測Ⅱ型膠原(COLⅡ)、Aggrean差異,組織學觀察TGF-β3對兔髓核細胞在PLGA支架微孔環(huán)境生長形態(tài)學改變。 結果 培養(yǎng)7、14、21 d后TGF-β3/PLGA組的髓核細胞活性、GAG產(chǎn)量、COL II及Aggrecan mRNA表達均高于PLGA對照組(P<0.05)。隨著TGF-β3濃度遞增,細胞活性及基質(zhì)表達有顯著增加(P<0.05)。21 d組織學HE染色顯示TGF-β3/PLGA組較PLGA對照組中微孔支架吸附、積聚更多髓核細胞生長。結論 TGF-β3對PLGA三維培養(yǎng)髓核細胞更好提高分化增殖能力,促進細胞基質(zhì)分泌。TGF-β3/PLGA支架可作為生物學治療退變椎間盤病變潛在選擇方法。

        TGF-β3;PLGA支架;兔髓核細胞;3-D培養(yǎng)

        脊柱退行性病變所致下腰痛仍是臨床常見疾病,對于骨科醫(yī)生及基礎研究者而言,通過逆轉椎間盤退行性改變進程來治療腰腿痛是面臨的一項巨大挑戰(zhàn)。近年來組織工程技術的迅速發(fā)展為椎間盤退變疾病提供了一種新的生物學治療方法[1-2]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)作為一種可吸收生物材料,提供合適的體外細胞生長環(huán)境,促進細胞黏附,增殖分化形成組織替代物, 進而修復重建已廣泛用于組織工程研究[3-7]。實驗研究結果表明生長因子可作為一種有效的生物治療方法,調(diào)控細胞基質(zhì)合成和基因表達,促進細胞增殖分化,組織再生從而修復受損椎間盤組織[8-11]。應用PLGA支架作為轉化生長因子β3(transforming growth factor-β,TGF-β3)載體,植入退變椎間盤以刺激形成類軟骨樣及成纖維細胞,促進椎間盤再生已有研究報道[12]。然而,體外研究TGF-β3對PLGA支架培養(yǎng)椎間盤細胞影響報道并不多。本研究利用可吸收PLGA支架3-D培養(yǎng)兔髓核細胞,評價TGF-β3對細胞生物活性影響,初步探討生物工程技術治療椎間盤退變的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗動物:健康普通級4周齡新西蘭白兔4只,雌雄不限,體質(zhì)量(2.50±0.50) kg,浙江省醫(yī)科院動物中心提供。許可證號:SYXK(浙)2014-0051,動物的飼養(yǎng)和實驗均得到醫(yī)院倫理委員會批準。

        1.1.2 主要試劑:DMEM-F12培養(yǎng)基、D-Hanks液、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清(Gibco公司)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、重組TGF-β3(Sigma-Aldrich公司);Trizol(Invitrogen公司)、逆轉錄試劑盒(Takala公司)、Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(北京中杉公司)、0.25%胰蛋白酶(上海澤衡生物公司),PLGA(中國紡織科學研究院);HE染色劑(武漢博士德生物公司),硫酸軟骨素(Sigma-Aldrich公司);

        1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司),倒置相差顯微鏡(CKX41 ,Olympas公司),酶標儀(Spark 20M,TECAN公司),細胞計數(shù)儀(BIO-RAD公司),掃描電鏡(JSM-IT300,Hitach公司),PCR儀(T100,BIO-RAD公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 兔椎間盤細胞分離培養(yǎng):1%戊巴比妥鈉100 mg/kg靜脈注射麻醉處死后,麻醉后無菌條件下獲取椎間盤,D-Hanks液沖洗3次,將椎間盤剪碎,Ⅱ型膠原酶和胰酶共同消化1 h。組織消化液渾濁后過濾, 細胞懸液1500 r/min離心2 min,收集細胞接種于培養(yǎng)瓶。37 ℃,5%CO2飽和濕度下,10%新生牛血清DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。用計數(shù)板計數(shù),按1×105/mL接種培養(yǎng)瓶中,每3 d換液,待細胞接近90%匯合時,以1:2傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長、增殖情況及形態(tài)特征并記錄。

        1.2.2 Ⅱ型膠原(COLⅡ)免疫組化染色:細胞爬片PBS洗滌后,用95%乙醇固定20 min,0.3%的過氧化氫處理10 min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,10%的血清封閉20 min,Ⅱ型膠原一抗[鼠抗兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體(1:50)],封閉4℃過夜,隨后添加二抗[鼠抗鼠IgG多克隆抗體(1:500)]在室溫下孵育1 h,DAB顯色1 h,封片觀察。以正常羊血清代替一抗作為陰性對照。陽性染色呈棕褐色或棕黃色。

        1.2.3 PLGA多孔支架制備與椎間盤細胞3-D培養(yǎng):應用粒子瀝濾法制備多孔PLGA支架,顆??讖酱笮〖s350~500 μm[13]。制成直徑10 mm,厚3 mm的圓柱體。70% 乙醇浸泡消毒2 h,蒸餾水換洗乙醇,干燥后密封包裝備用。根據(jù)O’Brien等[14]方法,先按照說明利用緩沖液稀釋TGF-β3至不同濃度,然后將PLGA支架浸泡TGF-β3稀釋液中, 4 ℃過夜24 h。最后在負壓(0.07~0.08 kPa),-20°條件下凍干,TGF-β3載入PLGA支架微孔。制成3組負載不同濃度的TGF-β3(100 ng/mL、500 ng/mL、1 μg/mL) PLGA支架以培養(yǎng)細胞用。

        實驗分組如下:100 ng/mL TGF-β3/PLGA,500 ng/mL TGF-β3/PLGA,1 μg/mL TGF-β3/PLGA,PLGA對照組。PLGA支架置于24孔培養(yǎng)板,每個PLGA支架滴加100 μL第2代細胞懸液進行接種(最終濃度為1×106/mL), 3 h后加入900 μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)1、7、14、21 d。

        1.2.4 MTT攝取:第1、7、14、21天檢測各組細胞增殖。每孔加入MTT(5 mg/mL) 100 μL染色, 37 ℃繼續(xù)孵育4 h, 收集上清液。再加入DMSO 1 mL,振蕩10 min充分溶解沉淀物后, 吸取待測液150 μL于96孔培養(yǎng)板,復孔6個,應用酶標儀570 nm波長檢測各孔吸光度A值。

        1.2.5 糖胺多糖含量測定:第1、7、14、21 天,各組分別取3-D培養(yǎng)上清液離心后置于-80 ℃冰箱中備檢。按照Tim等[15]的方法,將培養(yǎng)液收集入YM-50離心超濾管(Milipore) 后5000 g離心30 min,氨基多糖(glycosaminoglycan, GAG)濃度濃縮20倍。分別取20 μL濃縮的培養(yǎng)液與 200 μL 1,9-二甲基亞甲藍(DMMB)染液混合,復孔5個,酶標儀記錄波長525 nm處的吸光度A值。用硫酸軟骨素作標準曲線(0~150 μg/mL), 測定每個樣本的GAG濃度。

        1.2.6 qPCR 測定COL II、Aggrecan含量:于各時間點分別收集各組貼附支架的細胞,以Trizol試劑裂解細胞抽提細胞總RNA, 測定RNA濃度。然后將RNA反轉錄成cDNA, 以18 S rRNA為內(nèi)參, 利用cDNA為模板進行熒光定量PCR。反應條件: 95 ℃預變性5 min, 隨后95 ℃ 變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 共進行45個循環(huán), 再72 ℃延伸10 min。結果用100×2ΔCT(targeted gene)×10m(m=1,2,7)計算目的基因的相對表達量。本實驗所有引物由Invitrogen公司設計合成, 內(nèi)參18S rRNA上下游引物分別為5’-GGA TGG CTG TCT GAC CAA-3’和5’- GGG AGC AGT GAT GTG GAA CAC-3’; 其中COL II的上下游引物分別為5’- GAAGCA CAT CTG GTT TGG AG-3’和5’-TTG GGG TTG AGG GTT TTA CA-3’; Aggrecan的上下游分別為5’-GCA GGG ATA ACG GAC TGA AGT TC-3’和5’-GAT GGT TGA GGG ATG CTC ACA CT-3’。實驗結果檢測重復4次。

        1.2.7 組織學觀察:培養(yǎng)第7天后取2個細胞/PLGA復合體, PBS漂洗3次, 3% 戊二醛固定24 h, 掃描電鏡下觀察細胞在PLGA微孔內(nèi)部的生長情況。第21天后取出2 個細胞/PLGA復合體,10%甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、蠟塊包埋、切片(厚7 μm)、 HE染色,光鏡下進行組織學觀察。

        2 結果

        2.1 細胞形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡觀察,單層培養(yǎng)細胞于48 h后完成貼附伸展。原代細胞多為梭形或多角形,胞質(zhì)向外伸出多個長短不同的突起,輪廓清晰。中央有明顯1~2個類圓形核,見圖1。

        圖1 倒置相差顯微鏡觀察兔髓核細胞原代細胞(×60)Fig.1 The rabbit NPCs by inverted phase contrast microscope(×60)

        掃描電鏡觀察,體外PLGA支架培養(yǎng)7 d,細胞支架復合體內(nèi)可見大量髓核細胞伸展貼附于PLGA支架孔壁,并見偽足伸出,見圖2。

        圖2 掃描電鏡觀察PLGA孔隙內(nèi)附壁生長的兔髓核細胞(×623)Fig.2 The rabbit NPCs attached PLGA scaffolds by scanning electron microscope(×623)

        細胞爬片Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性,可見細胞核幾乎不著色;胞漿染色淡黃色,靠近核周明顯,并可見一些細小顆粒沉著,見圖3。

        圖3 兔髓核細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色形態(tài)表現(xiàn)(×200)Fig.3 Primary nucleus pulposus cells stained with collagen Ⅱ(×200)

        2.2 MTT法檢測細胞增殖結果 如表1所示,培養(yǎng)后第7、14、21天TGF-β3/PLGA各組A值均高于PLGA對照組, 500 ng/mL、1 μg/mL TGF-β3/PLGA組A值高于100 ng/mL TGF-β3/PLGA組及PLGA對照組,差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組A值隨培養(yǎng)時間的延長而增大,說明各組細胞數(shù)隨時間的增加而增加(P<0.05)。第14、21天同組間A值比較差異無統(tǒng)計學意義。

        表1 MTT法檢測各組細胞增殖變化

        *P<0.05,與同時間點PLGA對照組比較,compared with PLGA control group at the same time point;#P<0.05,與同時間點100 ng/mL TGF-β3/PLGA組比較,compared with 100 ng/mL TGF-β3/PLGA group at the same time point;△P<0.05,同組與第1天比較,compared with the same group on 1stday;▲P<0.05,同組與第7天比較,compared with the same group on 7thday

        2.3 DMMB法檢測GAG含量 隨培養(yǎng)時間的延長各組GAG含量逐漸增加。培養(yǎng)后第7、14、21天TGF-β3/PLGA組較PLGA對照組GAG含量明顯增加,500 ng/mL、1 μg/mL TGF-β3/PLGA組高于100ng/mL TGF-β3/PLGA及PLGA對照組,比較有顯著差異(P<0.05)。隨培養(yǎng)時間延長,第14天GAG含量明顯增加,21 d有所降低。比較第14、21天的結果顯示各組GAG含量無顯著差異。見表2。

        表2 DMMB法檢測各組GAG含量變化

        *P<0.05,與同時間點PLGA對照組比較,compared with PLGA control group at the same time point;#P<0.05,與同時間點100 ng/mL TGF-β3/PLGA組比較,compared with 100 ng/mL TGF-β3/PLGA group at the same time point;△P<0.05,同組與第1天比較,compared with the same group on 1stday;▲P<0.05,同組與第7天比較,compared with the same group on 7thday

        2.4 TGF-β3/PLGA對COL II、Aggrecan基因表達的影響 培養(yǎng)后的第7、14、21天TGF-β3/PLGA組較PLGA對照組COL II及Aggrecan mRNA表達明顯增強,500 ng/mL、1 μg/mL TGF-β3/PLGA組高于100 ng/mL TGF-β3/PLGA及PLGA對照組,比較有顯著差異(P<0.05)。見表3。

        表3 TGF-β3/PLGA對COL II、Aggrecan基因表達的影響

        *P<0.05,與同時間點PLGA對照組比較,compared with PLGA control group at the same time point;#P<0.05,與同時間點100 ng/mL TGF-β3/PLGA組比較,compared with 100 ng/mL TGF-β3/PLGA group at the same time point;△P<0.05,同組與第1天比較,compared with the same group on 1stday

        2.5 組織學觀察 培養(yǎng)21 d后TGF-β3/PLGA細胞支架復合體可見大量蘇木素著色的細胞貼附生長于PLGA支架微孔內(nèi),數(shù)量較多,細胞緊密接觸,形成類組織樣結構,支架呈透明無著色。 PLGA組貼附細胞較為稀疏沿著支架微孔壁黏附生長。見圖4。

        3 討論

        退行性椎間盤進行修復,恢復脊柱生理功能仍是脊柱外科醫(yī)生及研究者面臨的難題。一些研究報道利用組織工程方法將細胞-支架復合物植入或多功能干細胞直接注入病變椎間盤, 延緩椎間盤退變的過程已經(jīng)取得進展[16-19]。然而,選擇合適細胞來源、生物載體及有效因子逆轉這種椎間盤病理性退變過程仍存在諸多需要解決的問題。生物載體始終是技術關注的焦點,近年來各研究領域中新技術相互滲透,不斷發(fā)展出一些極具有良好應用前景、新型的生物支架[20-21]。PLGA聚酯化合物具有許多優(yōu)點,成為椎間盤組織工程的研究重點[7, 22]。PLGA可制備成為一定形狀,大小和內(nèi)孔隙結構的3-D多孔支架,依據(jù)不同細胞的生長要求進行調(diào)節(jié),因此,近來也廣泛應用于體外組織工程再生支架研究[23-24]。一些國內(nèi)外研究PLGA支架培養(yǎng)軟骨細胞在體修復膝關節(jié)骨軟骨缺損取得較好療效[5-6,25]。然而,椎間盤細胞的體外培養(yǎng)仍存在細胞分化增殖受限、細胞表型改變,影響逆行的修復效果[26]。因此,本研究選擇兔椎間盤髓核細胞與PLGA微孔支架進行3-D培養(yǎng),并應用生長因子TGF-β3進行體外誘導, 結果發(fā)現(xiàn)髓核細胞在第1天比較各組MTT、GAG及ColⅡ含量差異不明顯,可能與細胞剛開始貼壁生長有關,還沒有顯示不同濃度的TGF-β 3影響細胞生長及增殖。而第14天和21天,隨著更多細胞貼壁生長和TGF-β3濃度遞增,細胞增殖和代謝活動較為穩(wěn)定,TGF-β3/PLGA組中MTT、GAG及COLⅡ含量均顯著增加(P<0.05),說明PLGA多孔支架滿足接種髓核細胞的貼附,伸展及繁殖要求。掃描電鏡及組織學結果表明細胞較好地均勻分布,貼附、分化增殖于PLGA支架內(nèi)部的微孔表面,明確細胞與PLGA支架生良好的共存,PLGA支架為維持細胞的體外增殖和代謝活動提供適宜的微環(huán)境。因此,TGF-β3/PLGA支架3-D培養(yǎng)兔髓核細胞具備進一步修復的退變椎間盤先決條件。

        許多研究報道體外3-D細胞培養(yǎng),長時間地可持續(xù)性增殖后維持原有細胞表型及功能較為困難[6, 27]。生長因子調(diào)控、釋放,對保持細胞表型及功能具有重要作用,TGF-β3參與椎間盤細胞生長及表型調(diào)控,細胞在TGF-β3作用下可更好向正常椎間盤細胞表型分化[11, 28]。本研究使TGF-β3載入PLGA支架,結果表明3-D培養(yǎng)21d時TGF-β3仍可刺激細胞增殖。TGF-β3/PLGA支架組中細胞活性、細胞基質(zhì)均高于PLGA對照組(P<0.05), 大量活髓核細胞存在支架微孔內(nèi)較好貼壁與伸展。TGF-β3有效發(fā)揮對細胞增殖、分化及代謝的調(diào)節(jié)作用。近來在體研究表明PLGA具有與其它生物活性分子復合、控釋,從而對細胞的生長進行調(diào)控[9]。然而,體外對TGF-β3活性可調(diào)控性釋放,保持TGF-β3較好地分布在細胞附近, 不易流失也仍是體外細胞培養(yǎng)的一個難點。本研究采用凍干法將通過負壓、凍干吸附TGF-β3載入PLGA支架微孔,也證實PLGA支架能夠較好發(fā)揮TGF-β3載體功能,具有良好的細胞、生物因子載體優(yōu)勢。今后研究中有待進一步檢測TGF-β3的有效濃度,為將來構建新型復合的PLGA微粒或膠原纖維、凝膠、透明質(zhì)酸等生物材料,以更加有效控釋TGF-β3等生物因子。

        綜上所述,本實驗研究表明PLGA可作為髓核細胞良好的3-D支架載體,細胞附著支架微孔內(nèi)壁生長良好;TGF-β3載入PLGA支架更好促進椎間盤細胞增殖分化,為椎間盤退行性病變的生物治療提供一種新的途徑。

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        [26]Mern DS, Beierfuss A, Thome C, et al.Enhancing human nucleus pulposus cells for biological treatment approaches of degenerative intervertebral disc diseases: a systematic review[J].J Tissue Eng Regen Med, 2014, 8(12):925-936.

        [27]Lichtenberg A, Dumlu G, Walles T, et al.A multifunctional bioreactor for three-dimensional cell(co)-culture[J].Biomaterials, 2005, 26(5):555-562.

        [28]Chen YC, Su WY, Yang SH, et al.In situ forming hydrogels composed of oxidized high molecular weight hyaluronic acid and gelatin for nucleus pulposus regeneration[J].Acta biomaterialia, 2013, 9(2): 5181-5193.

        (編校:王儼儼)

        2016中國生化藥物前沿-精準醫(yī)學·創(chuàng)新藥物學術論壇暨《中國生化藥物雜志》編委會年會會議通知(第二輪)

        由中國藥學會生化與生物技術藥物專業(yè)委員會、北京大學藥學院、浙江大學藥學院、分子腫瘤學國家重點實驗室、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室、醫(yī)視界共同主辦,《中國生化藥物雜志》和北京數(shù)字時代科技有限公司共同承辦的“2016中國生化藥物前沿-精準醫(yī)學·創(chuàng)新藥物學術論壇暨《中國生化藥物雜志》編委會年會”將于2016年12月8日-10日在北京西藏大廈召開。

        一、大會組織

        主辦單位:

        中國藥學會生化與生物技術藥物專業(yè)委員會

        北京大學藥學院

        浙江大學藥學院

        分子腫瘤學國家重點實驗室

        天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室

        醫(yī)視界

        承辦單位:

        《中國生化藥物雜志》

        北京數(shù)字時代科技有限公司

        大會主席:詹啟敏

        大會副主席(按姓氏筆畫排列): 于榮敏 王鳳山 李利民 劉昭前 江 明 孫曉波 陳樞青 邱小波

        陳曉光 邵榮光 范慧紅 藥立波 凌沛學 黃 鏡 彭小忠 潘景軒

        學術顧問:陳志南 楊寶峰

        主任委員:詹啟敏

        副主任委員:周德敏 楊 波

        學術委員會委員(按姓氏筆畫排列): 于榮敏 王鳳山 葉文才 劉昭前 江 明 孫曉波 李為民 李利民

        楊 波 楊躍進 邱小波 陳樞青 陳建國 陳曉光 邵榮光 范慧紅

        周德敏 藥立波 凌沛學 黃 鏡 彭小忠 潘景軒 魏敏杰

        二、大會網(wǎng)站:2016fafbp.cbcpharm.com

        三、會議征文

        1.征文內(nèi)容:圍繞本次會議主題“精準醫(yī)學·創(chuàng)新藥物”的基礎研究、臨床應用及前沿綜述,具體內(nèi)容可涵蓋生化藥物各方面,包括化藥、植物藥、生物藥,從藥物分子結構設計等理論研究,植物有效成分提取工藝優(yōu)化等技術研究,基于生物信息學的分析研究,到臨床研究等。

        2.征文要求:原創(chuàng)并且在投稿截止前尚未發(fā)表的論文,主題明確、層次清晰、論據(jù)充分、數(shù)據(jù)可靠,400~800字中文摘要,摘要按照規(guī)定格式(目的、方法、結果和結論)寫作;正文4000~8000字。登錄www.cbcpharm.com在線投稿/查稿,并注明“會議征文”。

        3.所有論文將擇優(yōu)在《中國生化藥物雜志》發(fā)表。

        4.截稿時間:2016年11月25日

        四、聯(lián)系方式

        學術聯(lián)系人:吳 茜 010-84280076-8720;13581939531

        學術郵箱:wuxi@cyberzone.cn

        會務聯(lián)系人: 田小娟 010-84280076-8932;13810336853

        徐 艷010-84280076-8956:13810335932

        會務郵箱:tianxiaojuan@cyberzone.cn

        Effect of TGF-β3 on rabbit nucleus pulposus(NP) cells cultured in three-dimensional polylactic-co-glycolic acid scaffoldinvitro

        XIN Long1, XU Wei-xing1, YU Lei-jun1, SONG Hong-pu1, FAN Shun-wu2, WANG Zhen-bin3Δ

        (1.Department of Orthopaedics, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China; 2.Department of Orthopaedics, The Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310016, China; 3.Department of Orthopaedics, The Fourth Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumchi 830002, China)

        ObjectiveTo evaluate the effect of TGF-β3 on rabbit nucleus pulposus(NP) cells cultured in three-dimensional polylactic-co-glycolic acid (PLGA)scaffoldinvitro.MethodsPLGA scaffolds were fabricated by particulate leaching method and soaked in rabbit NP cells suspension(1×106/scaffold).PLGA-seeded NP cells were devided into 4 groups: 100 ng/mL TGF-β3/PLGA,500 ng/mL TGF-β3/PLGA,1 μg/mL TGF-β3/PLGA,PLGA control group.Cell proliferation activity was measured using MTT assay.The glycosaminoglycan(GAG) analysis were performed by 1,9-dimethylmethylene blue(DMMB) assay.mRNA expression was measured by quantitive PCR at each time point.Histological observation was performed to elucidate the morphological changes of NP cells in PLGA effected by TGF-β3.ResultsHigher cellular proliferation activity, GAG production,Collagen type II, Aggrean expression were observed in TGF-β3 /PLGA-seeded NP cells compared with PLGA control group on day-7,day-14,day-21(P<0.05).Higher dose of TGF-β3 exhibited intense cellular proliferation activity and peri-cellular matrix by increasing trend(P<0.05).Histological observation showed TGF-β3/PLGA developed more significant disc cells cluster than PLGA groups on day-21.ConclusionThe 3D porous PLGA scaffold-seeded cells using TGF-β3 can promotes cell proliferation, and prompt extracellular matrix(ECM) production.It is a potential biotherapy for the treatment of disc degeneration.

        TGF-β3; PLGA scaffold; rabbit nucleus pulposus cells; 3D cell culturing

        10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.007

        浙江省衛(wèi)計委科學研究基金(2010KYB026)

        辛龍,男,博士,主治醫(yī)師,研究方向:慢性下腰痛發(fā)病機制及臨床治療、脊柱退變、脊柱畸形、脊柱創(chuàng)傷、脊柱非融合技術及脊髓損傷,E-mail:xinlonghz@aliyun.com;王振斌,通信作者,男,博士,副主任醫(yī)師,研究方向:脊髓型頸椎病發(fā)病機制及臨床治療、脊柱退變、脊柱畸形、脊柱創(chuàng)傷及脊柱腫瘤,E-mail:wangzb0202@163.com。

        R826.64

        A

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