王馨，陳菲，王龍，謝鯤鵬，謝明杰

( 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

地榆對MRSA生物被膜形成的抑制作用

王馨?，陳菲?，王龍，謝鯤鵬，謝明杰Δ

( 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 研究地榆對MRSA41577菌株生物被膜(bacterial biofilm，BF)的抑制作用。方法 采用剛果紅法和結(jié)晶紫半定量法檢測供試菌株BF的形成能力；采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定地榆對MRSA41577BF形成和成熟BF的抑制作用，以及地榆與萬古霉素聯(lián)用對MRSA41577成熟BF的抑制作用。結(jié)果 地榆對MRSA41577BF形成和成熟BF有顯著的抑制作用，其抑制MRSA41577BF形成的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)分別為1 mg/mL和8 mg/mL。抑制MRSA41577成熟BF的MIC為4 mg/mL。當(dāng)用亞抑菌濃度的地榆與萬古霉素聯(lián)合作用后，可顯著提高成熟BF對萬古霉素的敏感性。萬古霉素的濃度≤64 μg/mL時，對MRSA41577成熟BF沒有破壞作用，當(dāng)1/4MIC的地榆與4 μg/mL萬古霉素聯(lián)用，即可對供試菌株成熟BF有抑制作用。結(jié)論 地榆對MRSA41577BF形成有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制與地榆破壞BF結(jié)構(gòu)，使萬古霉素等抗生素滲透到BF內(nèi)來完成殺菌作用有關(guān)。

地榆；MRSA；生物被膜

細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)峻，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以其多重耐藥性特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類和畜禽的健康。有報道顯示，在臨床感染中，MRSA感染占到了60%～80%，由MRSA引起的膿毒血癥及休克等嚴(yán)重并發(fā)癥，死亡率高達(dá)63.1%[1-2]。關(guān)于MRSA的耐藥機(jī)制，目前認(rèn)為細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)的形成是導(dǎo)致其耐藥的主要原因之一[3]。BF的形成可使細(xì)菌對藥物的敏感性降低，造成臨床上可以用于治療MRSA感染性疾病的抗生素種類日趨減少。因此，獲得抑制菌體BF形成的藥物，是解決MRSA臨床感染的有效途徑之一。目前研究顯示，中藥及其有效單體化合物，如地榆、五倍子、黃芩素以及和厚樸酚等對BF形成有顯著的抑制作用[4-5]。本文主要研究地榆對MRSA BF的影響，旨在為開發(fā)抗BF感染藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株：MRSA41577和1828由吉林醫(yī)大二院實(shí)驗(yàn)室提供。陰性對照菌株：StaphylococcusepidermidisATCC12228購于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品：地榆由遼寧師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室提供。氯代三苯基四氮唑(TTC)、萬古霉素和剛果紅等購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 地榆粗提物的制備：稱取一定量的地榆，用索氏提取器以95%的乙醇熱回流提取8 h后將提取液濃縮制成干粉。精確稱取一定量的干粉，將其用無水乙醇配制成濃度為350 mg/mL的母液，0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.2 供試MRSA菌株BF形成能力的定性和半定量檢測方法：定性檢測：采用剛果紅法測定[6]。多糖細(xì)胞間粘附素(PIA)是細(xì)菌BF的主要成分，對維持BF的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。剛果紅可與PIA結(jié)合并呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。首先將在含0.5% 葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的供試菌株和陰性對照的菌懸液，用玻璃棒點(diǎn)接種于剛果紅平板上，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落顏色。結(jié)果判斷：菌落為黑色、光亮和干燥的為產(chǎn)BF菌株；菌落為白色或紅色為不產(chǎn)BF菌株。半定量檢測：采用結(jié)晶紫法測定[7]。結(jié)晶紫半定量法是采用雙波長法，通過測定結(jié)晶紫與PIA的結(jié)合量，來衡量菌體產(chǎn)BF的能力。首先于96孔板中加入200 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的供試菌株和陰性對照的菌懸液(106cfu/mL)，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀測定595 nm下菌體的OD值。其次，小心將各孔中的上清液除去，PBS緩慢沖洗3次后，向每孔中加入200 μL 99%的甲醇固定10 min，除去甲醇，再在每孔中加入200 μL 2% 的結(jié)晶紫染色8 min，然后用無菌水沖洗至流水無色；待干燥后，每孔加入200 μL乙醇:丙酮(體積比=80:20)溶劑懸浮菌體，用酶標(biāo)儀測定570 nm下菌體的OD值。以0.5% 葡萄糖的LB培養(yǎng)基為空白對照。每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。產(chǎn)膜結(jié)果判斷[8]：OD570/OD595< ODC，為產(chǎn)BF陰性菌株；ODC4ODC，為產(chǎn)BF強(qiáng)菌株。ODC=OD570陰性對照+ 3SD(SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差)；OD570=OD570nm實(shí)驗(yàn)組-OD570nm空白組；OD595=OD595nm實(shí)驗(yàn)組-OD595nm空白組。

1.2.3 地榆抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC的測定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)[9]。于96孔板中，分別加入100 μL用含0.5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期的MRSA 41577菌懸液(106cfu/mL)，再加入10 μL不同濃度的地榆藥液，使其終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4和8 mg/mL，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，于各孔中加入20 μL 0.2%的TTC，避光培養(yǎng)4 h，觀察每孔顏色變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以不加藥物組為空白對照。MIC為沒有紅色還原物甲臢產(chǎn)生的最低藥物濃度。最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)的測定：從大于MIC的各孔中，分別吸取10 μL涂布于含0.5%葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌體的生長情況。MBC為平板上沒有菌體生長的最低藥物濃度。

1.2.4 地榆抑制MRSA 41577成熟BF的MIC和MBC的測定：用96孔板將MRSA培養(yǎng)3 d后即可得到菌體成熟的BF。將形成的BF用PBS緩慢沖洗3次后，分別加入200 μL含0.5%葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基和20 μL不同濃度的地榆藥液，使其終濃度分別為1、2、4、8、16、32和64 mg/mL，然后按照1.2.3的方法測定地榆對MRSA41577成熟BF的MIC及MBC。

1.2.5 地榆與萬古霉素的協(xié)同作用對MRSA 41577成熟BF的影響[10]：將在96孔板中培養(yǎng)3 d的成熟BF，用PBS洗3次后，在各孔中分別加入等量的萬古霉素和地榆，使萬古霉素的終濃度分別為0、2、4、8、16、32和64 μg/mL，地榆的終濃度分別為0、1/8 MIC、1/4MIC和1/2MIC，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，TTC法測定2種藥物的協(xié)同作用，每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 供試MRSA菌株產(chǎn)BF的測定結(jié)果 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，2種供試菌株的菌落顏色均為黑色，表明2者均可產(chǎn)生BF。結(jié)晶紫半定量法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3次檢測所得的ODC為(0.85±0.006)，供試菌株MRSA41577和1828的OD570/OD595值分別為(3.08±0.008)和(2.80±0.005)，均大于3ODC，表明2者均為產(chǎn)BF較強(qiáng)菌株。本文以產(chǎn)膜能力強(qiáng)的MRSA41577作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)菌株。

圖1 剛果紅平板實(shí)驗(yàn)檢測供試菌株產(chǎn)BF的能力1.陰性對照；2.MRSA1828；3.MRSA41577Fig.1 Biofilm-production ability of tested strains tested by Congo red agar1.negative control;2.MRSA1828；3.MRSA41577

2.2 地榆抑制MRSA41577 BF形成的MIC和MBC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，地榆對MRSA41577BF形成的抑制作用逐漸增強(qiáng)(表1)，其MIC為1 mg/mL。地榆也具有殺菌作用，其對MRSA41577的MBC為8 mg/mL。

表1 地榆抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC

“+++”為紅色，“++”為粉紅色，“+”為粉色，“-”為無色

2.3 地榆抑制MRSA41577菌株成熟BF形成的MIC和MBC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地榆對MRSA41577菌株成熟BF有較強(qiáng)的抑制作用，且呈濃度劑量依賴(見表2)，其MIC為4 mg/mL。當(dāng)?shù)赜軡舛刃∮?2 mg/mL時不能殺死BF內(nèi)細(xì)菌。

表2 地榆抑制MRSA41577成熟BF形成的MIC和MBC

“+ + +”為紅色；“+ +”為粉紅色；“+”為粉色；“-”為無色

2.4 地榆和萬古霉素聯(lián)用對MRSA41577成熟BF的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)萬古霉素的濃度≤64 μg/mL時，對MRSA41577菌株成熟BF沒有破壞作用，但與亞抑菌濃度的地榆聯(lián)合作用后，成熟BF對萬古霉素的敏感性顯著提高(見表3)。其中1/4MIC的地榆與4 μg/ml萬古霉素聯(lián)用時，即可對供試菌株成熟BF有抑制作用。表明地榆可破壞MRSA41577BF的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)萬古霉素滲透到膜內(nèi)完成其殺菌作用。

表3 地榆和萬古霉素的協(xié)同作用

“+”為紅色；“-”為無色

3 討論

BF的形成是導(dǎo)致MRSA耐藥的主要原因[11-12]，也是造成臨床上慢性持續(xù)感染的主要原因[13]。地榆是我國傳統(tǒng)的中藥材，是薔薇科地榆屬的多年生草本植物，其含有多種化學(xué)成分，包括鞣質(zhì)、三萜皂苷、黃酮、甾體等[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地榆對MRSA41577BF的形成及成熟BF均有較強(qiáng)的抑制作用，其中抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC分別為1和8 mg/mL。抑制成熟BF的MIC 4 mg/mL。

目前臨床上將萬古霉素作為MRSA治療的“最后防線”。但近年來發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)菌BF的形成，細(xì)菌對萬古霉素的敏感性降低[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)萬古霉素的濃度≤64 μg/mL時，其對MRSA41577成熟BF沒有破壞和殺滅作用，但當(dāng)與地榆聯(lián)合應(yīng)用時,4 μg/mL的萬古霉素即可對MRSA41577成熟BF起到殺菌作用。其原因可能是菌體形成的BF，使萬古霉素不能滲透到菌體內(nèi)部而發(fā)揮作用。而地榆可破壞BF的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)萬古霉素滲透到成熟BF內(nèi)完成殺菌作用。

綜上所述，地榆能顯著抑制MRSA 41577BF的形成，其作用機(jī)制與通過破壞BF的結(jié)構(gòu)，使萬古霉素等抗生素滲透到成熟BF內(nèi)來完成殺菌作用有關(guān)。關(guān)于地榆抑制MRSA BF形成的其他作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

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(編校：王儼儼)

Inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL. on MRSA biofilms formation

WANG Xin?, CHEN Fei?, WANG Long, XIE Kun-Peng, XIE Ming-JieΔ

(School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL.on biofilms of MRSA41577.MethodsCongo red agar method and crystal violet semi-quantitative method were used to detect the biofilms-forming ability of tested strains; TTC assay was used to detect inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL.on biofilms formation and mature biofilms of MRSA41577,as well as effects ofSanguisorbaofficinalisL.in combination with vancomycin on mature biofilms of MRSA41577.ResultsSanguisorbaofficinalisL.showed significant inhibitory both on biofilms formation and mature biofilms, minimum inhibitory concentration(MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) of biofilms formation were 1 mg/mL and 8 mg/mL,MIC of mature biofilms was 4 mg/mL.The sensitivity of mature biofilms to vancomycin was greatly increased whenSanguisorbaofficinalisL.was combined with vancomycin with subinhibitory concentrations.SanguisorbaofficinalisL.at 1/4 MIC can inhibit mature biofilms when combined with vancomycin at 4 μg/mL, while vancomycin didn’t show inhibitory effects on mature biofilms when concentrations were below 64 μg/mL.ConclusionSanguisorbaofficinalisL.has significant inhibitory on biofilms formation, the mechanism may be related toSanguisorbaofficinalisL.destroyed biofilms and make vancomycin penetrate into the biofilms to finish the bactericidal activity.

SanguisorbaofficinalisL.; MRSA; bacterial biofilm

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.006

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L201683675)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201602462)

王馨，女，學(xué)士在讀，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：974150173@qq.com；陳菲，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：739420029@qq.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

R285；Q939.92

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