陳紅兵　趙　磊　劉一民（山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500）

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胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后TLR4、NF-κB及I-κB表達(dá)的影響*

陳紅兵△趙磊劉一民
（山東省濰坊市益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500）

【摘要】目的觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）及核因子-κB抑制劑（I-κB）表達(dá)的影響。方法選取成年雌性健康大鼠72只，從中隨機(jī)選擇12只為空白對(duì)照組，其余60只大鼠采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷的模型。選取建模成功的36只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為胡黃連苷Ⅱ治療組、陽性對(duì)照組以及陰性對(duì)照組，每組12只。胡黃連苷Ⅱ治療組大鼠給予胡黃連苷Ⅱ注射干預(yù)，陽性對(duì)照組大鼠給予丹參素鈉干預(yù)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予磷酸鹽緩沖液（PBS）干預(yù)。采用TUNEL染色方法檢測3組大鼠的細(xì)胞凋亡情況；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測各組大鼠腦內(nèi)TLR4、NF-κB及I-κB表達(dá)的情況。結(jié)果空白對(duì)照組大鼠的TUNEL陽性細(xì)胞呈散在分布、數(shù)量較少，大鼠的海馬組織、紋狀體、大腦皮質(zhì)中TLR4、NF-κB及I-κB的表達(dá)較微弱；陰性對(duì)照組大鼠的TUNEL陽性細(xì)胞比空白對(duì)照組大鼠的數(shù)量顯著增加，海馬組織、紋狀體、大腦皮質(zhì)中TLR4、NF-κB及I-κB的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；胡黃連苷Ⅱ治療組以及陽性對(duì)照組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)、不同腦組織中TLR4、NF-κB及I-κB的表達(dá)均較陰性對(duì)照組大鼠低（P＜0.05），組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠來說，給予胡黃連苷Ⅱ治療可以下調(diào)大鼠TLR4、NF-κB及I-κB的表達(dá)，顯著的抑制大鼠的炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

【關(guān)鍵詞】胡黃連苷Ⅱ腦缺血再灌注損傷TLR4 NF-κB I-κB

在腦缺血再灌注損傷中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。Toll樣受體（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）及核固子-κB抑制劑（I-κB）在腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)中，能夠通過相應(yīng)的途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［1］。而相關(guān)研究表明，胡黃連苷Ⅱ可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［2］。本研究觀察了胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后TLR4、NF-κB及I-κB表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組選取成年雌性健康Wistar大鼠72只，體質(zhì)量240~260 g。在開始試驗(yàn)前，將72只大鼠提前1周放入實(shí)驗(yàn)室，使大鼠能夠適應(yīng)周圍的環(huán)境；實(shí)驗(yàn)室的溫度在23~25℃，給予大鼠自然光照、自由飲水、自由進(jìn)食，在相關(guān)方法干預(yù)前12 h禁食。從中隨機(jī)選擇12只為空白對(duì)照組，其余60只大鼠采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷的模型（缺血2 h，再灌注22 h）。選取建模成功的36只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為胡黃連苷Ⅱ治療組、陽性對(duì)照組以及陰性對(duì)照組，每組12只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法干預(yù)措施，在大鼠缺血2 h后，再灌注之前22 h進(jìn)行藥物干預(yù)。胡黃連苷Ⅱ治療組給予胡黃連苷Ⅱ注射，劑量為250 μL（10 mg/kg）；陽性對(duì)照組給予丹參素鈉干預(yù)，劑量為250 μL（10 mg/kg）；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組給予磷酸鹽緩沖液（PBS）干預(yù)。制備石蠟切片，從每組大鼠中分別選取6只，先用0.3 mL、10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定大鼠。分別使用250 mL的0.9%氯化鈉注射液、4%的甲醛溶液進(jìn)行灌注處理，之后取出大鼠腦組織放于4%的甲醛溶液進(jìn)行固定，時(shí)間為2 h，固定后使用蒸餾水進(jìn)行浸泡，時(shí)間為4 h。浸泡后使用梯度酒精進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明化，石蠟包埋。從大鼠的視交叉后進(jìn)行冠狀位切片處理，厚度為5 μm，將切取的組織置于載玻片上備用。TUNEL染色方法檢測細(xì)胞凋亡，將切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化、滅活處理，將新鮮稀釋的ProteinaseK在37℃下進(jìn)行消化處理，PBS沖洗3次；滴加適量標(biāo)記緩沖液后將切片置于濕盒中，在37℃的溫度下標(biāo)記2 h，PBS沖洗3次。加入封閉液，在室溫中約30 min后將封閉液甩去，加入稀釋過的抗地高辛抗體后，將切片置于濕盒中，在37℃下反應(yīng)30 min，PBS沖洗3次。取蒸餾水1 mL，將試劑盒中的3種試劑分別滴1滴至切片上，在室溫下進(jìn)行顯色。終止反應(yīng)時(shí)，可以使用蒸餾水進(jìn)行洗滌處理，并用梯度酒精進(jìn)行脫水，使用二甲苯進(jìn)行透明之后封片。將切片放置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄陽性細(xì)胞的數(shù)量。免疫組化染色，切片給予常規(guī)脫蠟、水化、染色，最后將切片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3觀察指標(biāo)采用TUNEL染色方法檢測3組大鼠的細(xì)胞凋亡情況；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測3組大鼠腦內(nèi)TLR4、NF-κB及I-κB表達(dá)的情況。凋亡細(xì)胞判定：顯微鏡下細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)黃褐色或者棕黃色的顆粒即為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠凋亡細(xì)胞的數(shù)量比較見表1。胡黃連苷Ⅱ治療組以及陽性對(duì)照組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)均較陰性對(duì)照組大鼠低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是此兩組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

表1　各組不同腦組織區(qū)域的TUNEL陽性凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表1　各組不同腦組織區(qū)域的TUNEL陽性凋亡細(xì)胞數(shù)比較（±s）

與陰性對(duì)照組比較，*　P＜0.05，**　P＜0.01。下同。

組別　n　海馬區(qū)皮質(zhì)區(qū)　紋狀體區(qū)空白對(duì)照組　6　2.22±1.14陰性對(duì)照組　611.31±2.23陽性對(duì)照組　6　5.22±1.82*　 3.52±1.12　 2.91±1.62 16.63±3.24 10.31±3.05 8.14±2.14*　6.11±2.30*　胡黃連苷Ⅱ治療組　6　5.14±1.45*　 7.65±2.07*　6.13±2.45*

2.2各組大鼠腦組織各區(qū)TLR4陽性細(xì)胞結(jié)果比較

見表2。胡黃連苷Ⅱ治療組以及陽性對(duì)照組大鼠TLR4陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)均較陰性對(duì)照組大鼠低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是此兩組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2　各組不同腦組織區(qū)域的TLR4陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2　各組不同腦組織區(qū)域的TLR4陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別　n　海馬區(qū)皮質(zhì)區(qū)　紋狀體區(qū)空白對(duì)照組　6　0.18±0.05陰性對(duì)照組　6　0.40±0.14陽性對(duì)照組　6　0.26±0.11*　 0.16±0.06　 0.22±0.08 0.45±0.17　 0.39±0.15 0.24±0.12*　 0.25±0.09*　胡黃連苷Ⅱ治療組　6　0.21±0.08*　 0.25±0.12*　 0.24±0.07*

2.3各組大鼠腦組織各區(qū)NF-κB及I-κB表達(dá)情況

見表3。胡黃連苷Ⅱ治療組以及陽性對(duì)照組大鼠NF-κB及I-κB陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)均較陰性對(duì)照組大鼠低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是此兩組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3　討　論

機(jī)體對(duì)缺氧最敏感的器官組織就是腦，腦的缺血、缺氧會(huì)導(dǎo)致其不可逆的功能損害，嚴(yán)重者還會(huì)發(fā)生梗死，嚴(yán)重的威脅著機(jī)體的生命健康，所以需要及時(shí)地恢復(fù)腦血流。但是，腦組織的缺血再灌注也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的損害。隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，體內(nèi)的興奮性氨基酸含量逐漸降低，抑制性氨基酸含量逐漸升高，腦細(xì)胞會(huì)發(fā)生相應(yīng)的結(jié)構(gòu)改變，例如：線粒體的腫脹、染色體的凝集、微血栓的形成等，給機(jī)體帶來不同程度的損害［3-4］。

表3　兩組NF-κB及I-κB陽性細(xì)胞表達(dá)情況比較（±s）

表3　兩組NF-κB及I-κB陽性細(xì)胞表達(dá)情況比較（±s）

NF-κB　I-κB皮質(zhì)區(qū)　紋狀體區(qū)　海馬區(qū)　皮質(zhì)區(qū)　紋狀體區(qū)　海馬區(qū)空白對(duì)照組　6 0.15±0.07 0.13±0.05 0.17±0.04　 0.14±0.04 0.13±0.06 0.15±0.03陰性對(duì)照組　6 0.57±0.16 0.54±0.20 0.55±0.15　 0.40±0.14 0.39±0.15 0.41±0.13陽性對(duì)照組　6 0.26±0.14*　0.23±0.12*　0.22±0.11*　0.26±0.09*　0.24±0.08*　0.27±0.10*　胡黃連苷Ⅱ治療組　6 0.24±0.07*　0.21±0.11*　0.24±0.10*　0.23±0.10*　0.21±0.09*　0.22±0.09*　組別　n

本研究在對(duì)大鼠進(jìn)行治療干預(yù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)缺血再灌注損傷比較敏感的大鼠其皮質(zhì)、紋狀體、海馬部位的TLR4、NF-κB、I-κB的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組大鼠，說明了大鼠體內(nèi)的損傷因子通過使TLR4、NF-κB、I-κB的表達(dá)增加，激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)凋亡細(xì)胞的增加。而注射胡黃連苷Ⅱ的大鼠，其各項(xiàng)指標(biāo)均比陰性對(duì)照組降低。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因?yàn)椋篢LR4通過與接頭蛋白結(jié)合、與白介素相關(guān)激酶結(jié)合，可以促進(jìn)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的移位，從而啟動(dòng)與炎癥反應(yīng)、非特異性免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。腦缺血再灌注損傷時(shí)，會(huì)使大鼠的非特異性免疫系統(tǒng)激活，同時(shí)激活TLR4- NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、I-κB激酶，使I-κB上的絲氨酸殘基發(fā)生泛素化與磷酸化。最終誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)指標(biāo)的升高。

TLR4是Toll樣受體的一種，在機(jī)體的非特異性免疫中發(fā)揮著重要的作用［5］。NF-κB是一組二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel蛋白家族，可以調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥、免疫反應(yīng)等相關(guān)基因的表達(dá)［6-8］。研究表明，NF-κB在炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)中占據(jù)重要的地位［9］。NF-κB二聚體可以是同源性二聚體或者異源性二聚體，由多肽鏈p65及p50組成［10］。NF-κB異源性二聚體的活性比較強(qiáng)，通過與抑制因子I-κB的結(jié)合，可以形成一個(gè)沒有活性的三聚體并存在于細(xì)胞質(zhì)中［11-12］。I-κB家族中一共有7個(gè)成員，其中其主要作用的為I-κBα。之后泛素化的I-κB會(huì)在蛋白酶的作用下降解，導(dǎo)致NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，通過與特定的DNA序列相結(jié)合，使相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的翻譯，并形成正反饋導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生［13-15］。

綜上所述，胡黃連苷Ⅱ治療可以下調(diào)大鼠TLR4、NF-κB及I-κB的表達(dá)，顯著地抑制大鼠的炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

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Effects of PicrosideⅡon the Expression of TLR4，NFκB and I-κB in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

CHEN Hongbing，ZHAO Lei，LIU Yimin.
Yidu Central Hospital of Weifang，Shandong，Weifang 262500，China.

【Abstract】Objective：To discuss the effects of picrosideⅡon the expression of TLR4，NFκB and I-κB in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods：72 cases of healthy adult female rats were chosen，from which，12 cases were randomly selected as the blank control group，and the rest of the 60 rats were established as middle cerebral artery ischemia-reperfusion injury model with suture method. 36 rats of successful model were selected and randomly divided into 3 groups：the picrosideⅡtreatment group，the positive control group and the negative control group（12 cases in each）with random number table method. The picrosideⅡtreatment group was given picrosideⅡinjection intervention，the positive control group danshensu sodium intervention，the blank control group and negative control group phosphate buffer（PBS）intervention. Apoptosis of the above groups were observed with TUNEL staining method. The expression of TLR4，NFκB and I-κB were observed with immunohistochemical staining method. Results：TUNEL-positive cells of blank control group were scattered，small number，and the expression of TLR4，NFκB and I-κB in hippocampal tissue，striatum，cerebral cortex were relatively weak；TUNEL-positive cells of negative control group significantly increased than the blank control group，and the expression of TLR4，NF-κB and I-κB in hippocampal tissue，striatum，cerebral cortex significantly increased compared with the control group（P＜0.05）；TUNEL-positive cells and the expression of TLR4，NF-κB and I-κB of picrosideⅡtreatment group，positive control group were lower than those in the the negative control group（P＜0.05），but there was no statistically significant difference between the two groups（P＞0.05）. Conclusion：For the rats with cerebral ischemia reperfusion injury，picrosideⅡtreatment can cut the expression of TLR4，NF-κB andI-κB，and significantly inhibit the inflammatory response in rats and neuronal apoptosis.

【Key words】PicrosideⅡ；Cerebral ischemia-reperfusion injury；TLR4；NF-κB；I-κB

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）02-0242-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.017

*基金項(xiàng)目：山東省濰坊市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目計(jì)劃（2014007）

通信作者△（電子郵箱：chb0536@aliyun.com）

收稿日期（2015-11-27）