劉晨敏　范紅晶　張宇燕　楊潔紅　萬(wàn)海同（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

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補(bǔ)陽(yáng)還五湯中生物堿提取工藝的優(yōu)化研究*

劉晨敏范紅晶張宇燕△楊潔紅萬(wàn)海同（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

【摘要】目的優(yōu)化補(bǔ)陽(yáng)還五湯中總生物堿的提取工藝。方法用酸性染料比色法建立總生物堿含量的測(cè)定方法；采用L9（34）正交設(shè)計(jì)考察乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)等因素，以總生物堿含量為指標(biāo)，優(yōu)選總生物堿的提取工藝。結(jié)果補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿的最佳工藝為：8倍量90%乙醇提取3次。結(jié)論優(yōu)化的補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿提取工藝條件，可為補(bǔ)陽(yáng)還五湯方藥的深入研究奠定基礎(chǔ)，也可為相關(guān)制劑研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿正交設(shè)計(jì)提取工藝

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，載于《醫(yī)林改錯(cuò)》中，具有補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)之功效，主治中風(fēng)后遺癥，屬氣虛血瘀證，臨床主要用于治療中風(fēng)和中風(fēng)后遺癥引起的口角流涎、言語(yǔ)不清、肢體麻木、遺尿不禁、半身不遂等疾?。?-4］。前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中主要含有豐富的生物堿、黃酮、皂苷、多糖等多個(gè)有效部位，川芎嗪等生物堿類(lèi)成分具有擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量、改善微循環(huán)以及抑制血小板聚集等作用［5-7］，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化補(bǔ)陽(yáng)還五湯中總生物堿的提取工藝，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯方藥的深入研究奠定基礎(chǔ)，為相關(guān)制劑研究提供參考。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材　料

AG135電子天平（靈敏度0.0001 g）：梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花：購(gòu)自北京同仁堂杭州藥店有限公司；鹽酸川芎嗪（110817-200305）來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；其余均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取鹽酸川芎嗪對(duì)照品5.5 mg，置10 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，作為0.55 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備按補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方（黃芪60 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g）稱(chēng)取原藥材共111 g，加入8倍體積的70%乙醇回流提取3次，每次1 h，提取液減壓濃縮至100 mL，抽濾，濾液用石油醚萃取脫脂，回收石油醚，取下層液用70%的乙醇定容于150 mL。

2.3最大吸收波長(zhǎng)的確定將對(duì)照品溶液、樣品供試液和空白對(duì)照液0.5 mL，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚綠指示液2 mL，置分液漏斗中，再加氯仿9.5 mL，充分振搖，靜置1 h，分取氯仿層，加無(wú)水Na2SO4脫水后，在350～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示前兩者在415 nm均有最大吸收值，且吸收峰相同，而空白對(duì)照液在415 nm幾乎沒(méi)有吸收，故本實(shí)驗(yàn)選擇415 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于分液漏斗中，分別加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚綠指示液2 mL，充分振搖，靜置1 h，分取氯仿層，并定容至10 mL。加無(wú)水Na2SO4脫水后于415 nm下測(cè)定吸光度值，以吸光度（Asb）與其相對(duì)應(yīng)的濃度（μg/mL）作線性回歸，得到線性回歸方程為：y=0.0225x-0.0045，r2=0.9992，線性范圍5.5～33.0 μg/mL。

2.5精密度試驗(yàn)精密量取配制好的對(duì)照品溶液0.3 mL，置10 mL具塞錐形瓶中，依法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.17%，表明精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，依法顯色，每隔2小時(shí)測(cè)定其吸收度1次，結(jié)果表明，自加完顯色劑開(kāi)始其吸光度在12 h內(nèi)幾乎無(wú)變化，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.13%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)取同批藥材，制備供試品溶液，測(cè)定其含量，以定容液的濃度表示，重復(fù)進(jìn)行6次。計(jì)算求得生物堿濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.03%，表明重現(xiàn)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取5份已知含量的同批藥材，分別加川芎嗪對(duì)照品，依法操作，測(cè)吸光度，計(jì)算得川芎嗪的平均回收率為96.80%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.16%。

2.9正交優(yōu)化提取工藝實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度、溶劑用量、提取次數(shù)等3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用L9（34）正交法安排實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），按照“供試品溶液”項(xiàng)下方法，并以正交表的試驗(yàn)條件制備供試品溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下于415 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算生物堿得率，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2，表3。

表1　因素水平表

結(jié)果分析，以總生物堿得率為指標(biāo)，則：影響因素程度依次為C＞A＞B。其中A因素：無(wú)顯著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。B因素：無(wú)顯著性影響，且Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。C因素：顯著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。由上可見(jiàn)，最佳提取條件應(yīng)為A3B2C3。

2.10工藝驗(yàn)證取補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥材按最佳工藝條件進(jìn)行提取3次，測(cè)定其生物堿得率，進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表4，表明該最佳提取工藝得率較高，工藝基本可行。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

表4　工藝驗(yàn)證結(jié)果

3　討　論

影響補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿提取的主要因素有乙醇濃度、提取次數(shù)、溶劑倍量、提取時(shí)間等。通過(guò)預(yù)試，本實(shí)驗(yàn)確定以乙醇濃度、提取次數(shù)、溶劑倍量為考察因素，并設(shè)置了相應(yīng)的不同水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿提取的最佳提取工藝為：加8倍量90%乙醇提取3次，得到補(bǔ)陽(yáng)還五湯總生物堿的平均提取率為89.16%，該工藝及設(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低，可行性好，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯的進(jìn)一步研究和制劑開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］陳冬，楊潔紅.補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗腦缺血作用的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（1）：72-74.

［2］付珍萍，趙斌，秦展宏.補(bǔ)陽(yáng)還五湯臨床應(yīng)用規(guī)律探源［J］.甘肅中醫(yī)，2010，23（9）：66-68.

［3］黃愛(ài)華.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療中風(fēng)偏癱后遺癥臨床療效分析［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（3）：161-163.

［4］郭東明，郭亞榮.補(bǔ)陽(yáng)還五湯臨床應(yīng)用淺析［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（8）：55-56.

［5］吳旋，汪欣，陳云歡，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP的影響研究［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（12）：30-32.

［6］龍建飛，張秋霞，王蕾，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性中風(fēng)藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.世界中醫(yī)藥，2015，10（5）：805-807.

［7］羅銀河，葛金文，劉林.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性中風(fēng)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（2）：269-271.

Op timization of Extraction Process of Alkaloid in Buyang Huanwu Decoction

LIU Chenmin，F(xiàn)AN Hongjing，ZHANG Yuyan，et al.
Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective：To optimize extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction. Methods：The determination of the content of total alkaloid was established with acid dye colorimetry method. With L9（34）orthogonal design experiment，and by inspecting the extraction ethanol，ethanol concentration，extraction etc，the best extraction technology of total alkaloid in Buyang Huanwu decoction was selected. Results：The best process was 8 times the amount of 90%ethanol extracted for 3 times. Conclusion：Optimization of extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction can lay the foundation for the further study and provide references for the relevant development of preparations.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Total alkaloid；Orthogonal design；Optimum extraction

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）02-0197-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.003

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81202636，81274176）；浙江省自然科學(xué)基金（No.LZ14H270001）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2016ZZ2010）

通信作者△（電子郵箱：yannoo7376＠sina.com）

收稿日期（2015-10-10）