金振宇, 劉宏偉

(同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200072)

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·基礎(chǔ)研究·

頜骨骨髓基質(zhì)細胞對牙周膜細胞生物學(xué)特性的影響

金振宇, 劉宏偉

(同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200072)

目的 觀察間接共培養(yǎng)犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)對犬牙周膜細胞(canine periodontal ligament cells, cPDLCs)生物學(xué)特性的影響。方法 原代培養(yǎng)犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞和犬牙周膜細胞。MTT法檢測犬牙周膜細胞增殖速率；利用Transwell結(jié)構(gòu)建立犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞與犬牙周膜細胞共培養(yǎng)體系；qPCR法檢測犬牙周膜細胞礦化相關(guān)基因核心結(jié)合因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)的變化；Western印跡法檢測Runx2和OCN蛋白的表達變化。構(gòu)建牙片/細胞膜片復(fù)合體植入裸鼠皮下。結(jié)果 兩種細胞體外均貼壁生長，呈紡錘狀外形；頜骨骨髓基質(zhì)細胞間接共培養(yǎng)下對牙周膜細胞增殖有抑制作用；共培養(yǎng)組牙周膜細胞ALP活性高于對照組；qPCR和Western印跡法均能檢測到牙周膜細胞Runx2、OCN的表達，共培養(yǎng)組牙周膜細胞的Runx2和OCN的表達均高于對照組。經(jīng)過頜骨骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的牙周膜細胞與牙本質(zhì)片復(fù)合形成了排列更加有序的牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，單純的牙周膜細胞膜片不能新生類似的牙周組織復(fù)合結(jié)構(gòu)。結(jié)論 犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞間接共培養(yǎng)情況下可能會限制牙周膜細胞的增殖，促進牙周膜細胞向成骨樣細胞分化。

頜骨骨髓基質(zhì)細胞； 牙周膜細胞； 共培養(yǎng)； 條件培養(yǎng)液

牙周炎作為厭氧菌為主的慢性感染性疾病，是成人牙齒脫落的主要原因。牙周治療的理想目的是實現(xiàn)牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜再生?；A(chǔ)治療和引導(dǎo)組織再生術(shù)配合藥物使用暫不能實現(xiàn)該目的。目前牙周再生主要集中在聯(lián)合使用高效的生長因子、具有多向分化潛能的種子細胞和體內(nèi)可吸收無免疫排斥的材料上。選擇理想種子細胞是牙周組織完整再生的關(guān)鍵。牙周膜細胞和頜骨骨髓基質(zhì)細胞是構(gòu)成牙周組織的兩種重要的細胞[1]。牙周膜細胞因部位的不同而存在生物特性差異。牙骨質(zhì)附著的牙周膜細胞成骨分化潛能弱于牙槽骨表面的牙周膜細胞[2]。本實驗通過建立犬牙周膜細胞(canine periodontal ligamentcells, cPDLCs)與犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，探討犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞對牙周膜細胞誘導(dǎo)分化的影響，為深入分析在頜骨微環(huán)境中，牙周膜細胞的生物學(xué)行為以及分化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

12月齡雄性Beagle犬2只，體質(zhì)量約12kg，購自第二軍醫(yī)大學(xué)動物研究中心。改良型ɑ-MEM培養(yǎng)基、提取RNA試劑TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司;0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自美國HyClone公司；Transwell培養(yǎng)器(0.4μm孔徑)購自美國Millipore公司；SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；5×蛋白上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液購自江蘇碧云天生物科技有限公司；蛋白Marker購自美國Thermo公司；兔抗Runx2多克隆抗體(bs-0026R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗波形絲蛋白抗體(sc-3737117)購自美國Santa Cruz公司；鼠抗OCN多克隆抗體(ab-13418)購自英國Abcam公司；GAPDH小鼠單克隆抗體(SAM1003)購自南京生興生物公司；羊抗鼠IgG(GMI01)購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG(ZB-2301)購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司；離心管購自美國Corning公司；各型號培養(yǎng)板購自美國Costar公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

超凈工作臺購自Forma Scientific公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)、照相系統(tǒng)購自日本Nikon公司；Mastercycler Personal PCR儀購自德國Eppendorf公司；Coic倒置相差顯微鏡購自重慶光電設(shè)備廠；實時熒光定量PCR儀(Rotor Gene 3000)購自澳大利亞Corbett公司；分光光度計購自英國Amersham bioscience公司；SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 犬牙周膜細胞的分離培養(yǎng) 選取1歲雄性比格犬，以3%戊巴比妥靜脈注射，行全身麻醉，無菌條件下拔除上前磨牙。剝離根中1/3牙周膜軟組織，剪碎成約1.0mm3小塊，平鋪于胎牛血清預(yù)處理的培養(yǎng)瓶底。加入完全培養(yǎng)液4.5ml，放入細胞培養(yǎng)孵箱。在37℃、5%CO2、100%濕度條件的孵箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞爬出情況[3]。當(dāng)增殖后密度約占瓶底80%時，含EDTA胰酶消化，1∶2或1∶3傳代(取決于細胞數(shù)量)。取3～4代細胞進行實驗。制備細胞爬片，波形絲蛋白抗體行免疫染色鑒定。

1.2.2 犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 犬上頜骨前磨牙區(qū)(前磨牙已于3個月前拔除，拔牙區(qū)軟組織完全愈合)切開黏膜、剝離全厚粘骨膜瓣、露出骨面，種植機結(jié)合取骨鉆(直徑3.5mm)鉆取骨松質(zhì)塊[4]。無菌生理鹽水反復(fù)沖洗8～10次，組織研磨器磨碎松質(zhì)骨塊，接種于血清預(yù)處理的六孔板中，于 37℃、5%CO2、100%濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中靜置。3d后換50%培養(yǎng)液，5d后換全部培養(yǎng)液。當(dāng)細胞鋪滿瓶底約80%時，用質(zhì)量分數(shù)0.25%的胰酶消化，1∶2傳代。第3～4代細胞用于實驗。

1.2.3 實驗分組 (1) 對照組： 單獨培養(yǎng)cPDLCs；(2) 實驗組： Transwell共培養(yǎng)組： 先接種cM-BMSCs于六孔板中，待細胞融合至70%時，按MilliporeTranswell的操作步驟，放入Transwell小室，培養(yǎng)液能交換互通，但內(nèi)外細胞不能直接接觸，小室中為融合度70%的貼壁cPDLCs(圖1)。

圖1 細胞共培養(yǎng)模型Fig.1 Model of cells, co-culture system

1.2.4 犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液的制備 第三代犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞傳代于T25細胞培養(yǎng)瓶中。待細胞鋪滿約85%瓶底后，棄去含血清培養(yǎng)基，PBS洗2遍，更換成無血清ɑ-MEM培養(yǎng)液4.5ml。24h后收集上清液，離心半徑30cm，2500r/min，離心5min，上清液即為頜骨骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液(cM-BMSCs-CM)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 MTT檢測 犬牙周膜細胞分實驗組、對照組，分別接種于96孔板中，每孔植入約2000個細胞，兩組細胞貼壁后更換培養(yǎng)液，記為第1天。對照組、實驗組加含10%血清的培養(yǎng)基200μl，處理組取cM-BMSCs-CM與含20%FBS的培養(yǎng)液1∶1混合，加200μl于孔中，連續(xù)培養(yǎng)7d。每日取各3孔兩組細胞，加20μl MTT試劑(5g/L)，避光孵育4h，去上清液，各孔加DMSO 150μl，搖床避光振蕩 10min，酶標儀在490nm波長下讀取各孔D490值，取均數(shù)以時間為橫軸、光度值為縱軸記錄生長曲線。

1.2.6 qPCR檢測犬牙周膜細胞Runx2和ALP、OCN的mRNA表達 細胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄： 2個六孔板的Transwell小室的牙周膜細胞為一組。用TRIzol裂解細胞提取總RNA，紫外吸收法測定RNA純度和濃度。500ng RNA用隨機引物Oligo(dT)12-18行反轉(zhuǎn)錄。依照qPCR試劑盒說明，加入引物序列，使用實時qPCR儀進行反應(yīng)，合成所需的目的基因(表1)。

表1 qPCR引物序列

1.2.7 Western印跡法檢測犬牙周膜細胞Runx2和OCN蛋白表達 采用RIPA法提取細胞蛋白，依BCA法檢測蛋白濃度并統(tǒng)一上樣蛋白量，15%分離膠和5%濃縮膠行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、放入BSA封閉液中搖床上封閉2h，一抗孵育過夜，二抗孵育2h，行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。分析犬牙周膜細胞OPN和Runx2蛋白表達情況。

1.2.8 牙片/細胞膜片復(fù)合體的構(gòu)建與裸鼠植入 cPDLCs膜片形成后，細胞刮刮起膜片小心包裹牙本質(zhì)片3層[5]，形成牙本質(zhì)片/膜片復(fù)合體，植入裸鼠皮下，每只左右各植入一移植物，共6只裸鼠。術(shù)后7周取樣，4℃多聚甲醛固定，脫鈣包埋切片，H-E染色。(1) 實驗組： 頜骨骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的牙周膜細胞膜片+牙本質(zhì)片；(2) 對照組，單純牙周膜細胞膜片+牙本質(zhì)片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用軟件SPSS 17.0行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，組間樣本比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果

實驗中組織塊法培養(yǎng)cPDLCs，接種后6h組織塊貼壁，培養(yǎng)第6天可見貼壁組織塊周緣少量原代細胞陸續(xù)游出，隨著時間延續(xù)，細胞圍繞組織塊呈放射狀生長，細胞逐漸密集。15～20d后，部分區(qū)域融合度達到70%，可消化傳代記為P1。傳代后細胞呈長梭形，成纖維細胞樣外形(圖2A)，生長旺盛。取第3代犬牙周膜細胞參照SABC免疫組化檢測抗波形蛋白陽性，確認培養(yǎng)細胞是源于中胚層的成纖維樣細胞(圖2B)。

2.2 犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞

翻開全厚瓣，暴露犬上頜骨骨面，取骨環(huán)鉆鉆取骨松質(zhì)塊，5d后貼壁骨塊周緣有細胞移出。5d后換液。當(dāng)細胞爬滿瓶底約75%時，胰酶消化，1∶3傳代。取第2～3代細胞(圖3)行體外試驗。

圖2 犬牙周膜細胞形態(tài)與染色Fig.2 Morphology of canine periodontal ligament cells on SABC stainingA(×100)： 犬牙周膜細胞形態(tài)；B(×100)： 犬牙周膜細胞波形絲蛋白染色

圖3 犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞原代培養(yǎng)(×100)Fig.3 Primary culture of canine maxillary bone marrow stromal cells(×100)原代培養(yǎng)第二代，細胞呈梭形，貼壁生長

2.3 cM-BMSCs-CM對cPDLCs增殖的影響

依據(jù)生長曲線可以看出，第1天時，兩組細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義；未處理的牙周膜細胞在第2天開始快速增殖，而實驗組牙周膜細胞經(jīng)頜骨骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)后增殖緩慢；第5～7天時，未處理組牙周膜細胞增殖較快，實驗組細胞分裂緩慢(圖4)。

圖4 MTT檢測兩組細胞增殖情況Fig.4 Cell proliferation tested measured by MTT method

2.4 共培養(yǎng)的犬牙周膜細胞在第3、7天ALP、Runx2、OCN的mRNA表達變化

熒光定量PCR檢測目的基因Runx2、ALP及OCN結(jié)果顯示： 與對照組相比，實驗組相關(guān)基因的表達均高于對照組，存在顯著差異。實驗組Runx2、ALP及OCN的表達第3、7天均高于未誘導(dǎo)的牙周膜細胞，但第3天較第7天高(表2)。

表2 各標志物mRNA的RQ值

2.5 犬牙周膜細胞相關(guān)蛋白的表達

采用Western印跡法檢測牙周膜細胞間接共培養(yǎng)后第0、3、7天的蛋白表達水平。結(jié)果顯示： 共培養(yǎng)的第3天，OCN和Runx2蛋白表達水平最高，第 3～7天蛋白水平有所下降，但均較對照組高(圖5)。

圖5 Western印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達Fig.5 Detection of related proteins by Western blotting

2.6 H-E切片染色結(jié)果

對照組可見到較少的與牙片表面平行的膠原纖維和成纖維細胞的存在，與牙片之間分離(圖6A)。實驗組可見到牙片表面有類似鈣化物沉積并可見大量的成纖維細胞和膠原纖維，期間可見再生的血管(圖6B)。

圖6 牙周膜細胞膜片復(fù)合牙本質(zhì)片裸鼠皮下移植H-E染色觀察Fig.6 H-E staining of the indirect co-cultured PDLCs or PDLCs alone after transplant in nude miceA： 對照組H-E染色，新生膠原纖維；B： 實驗組H-E染色，新生類牙周膜纖維、類牙骨質(zhì)

3 討 論

牙周炎癥控制后，牙周組織會有以下不同的愈合方式： (1) 牙齦結(jié)締組織附著，根面吸收；(2) 長上皮結(jié)合；(3) 牙槽骨與根面牙骨質(zhì)直接接觸；(4) 牙周膜細胞的修復(fù)，重新形成新附著[3]。牙周膜細胞含前體細胞，表現(xiàn)出多向分化潛能，可誘導(dǎo)形成成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞。牙周膜細胞和頜骨骨髓基質(zhì)細胞都是牙周組織的重要組成成分。本研究參考Park等[6]的取材及細胞培養(yǎng)方式，鉆取頜骨骨松質(zhì)塊，組織塊法培養(yǎng)頜骨骨髓基質(zhì)細胞。

牙周膜細胞是一組異質(zhì)性的細胞群，由成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞、微血管內(nèi)皮細胞及未分化的間充質(zhì)干細胞等組成。研究[2]發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細胞較多存在于附著在牙槽骨面的牙周膜中，牙槽骨側(cè)的牙周膜細胞較根面的牙周膜細胞具有更強的增殖能力和成骨分化的潛能。Mizuno等[7]通過共培養(yǎng)人PDLCs和BMSCs，發(fā)現(xiàn)促進了骨髓基質(zhì)間充質(zhì)細胞的增殖和成骨分化。Kelm等[8]發(fā)現(xiàn)長骨骨髓腔內(nèi)的BMSCs與PDLSCs在體外共培養(yǎng)之后植入裸鼠，獲得了牙周膜樣組織結(jié)構(gòu)并免疫組化切片證實骨橋蛋白低表達，高表達骨鈣素。牙周膜細胞參與牙周組織再生離不開頜骨微環(huán)境。源于神經(jīng)嵴的頜骨骨髓間充質(zhì)細胞和中胚層來源的脛骨骨髓間充質(zhì)細胞呈現(xiàn)出不同的生物學(xué)特征，頜骨骨髓間充質(zhì)細胞表現(xiàn)為更強的成骨能力。本實驗采用頜骨骨髓基質(zhì)細胞與牙周膜細胞建立Transwell共培養(yǎng)模型，希望模擬活體中頜骨環(huán)境對牙周膜細胞的分化影響。

骨髓基質(zhì)細胞旁分泌作用可通過分泌多種細胞因子、干細胞歸巢因子，下調(diào)促凋亡蛋白等多種途徑。更為普遍的看法則是認為直接和間接共培養(yǎng)均可誘導(dǎo)干細胞的定向分化。本研究通過細胞共培養(yǎng)技術(shù)[9]，觀察頜骨骨髓基質(zhì)細胞釋放的因子對牙周膜成纖維細胞的影響，在一定程度上，進一步模擬了細胞分化的微環(huán)境[10]，能更好地觀察頜骨骨髓基質(zhì)細胞對牙周膜細胞增殖和分化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)作用下，實驗組牙周膜細胞增殖開始時慢于單純牙周膜細胞，且兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明頜骨骨髓基質(zhì)細胞抑制了牙周膜細胞的增殖。頜骨骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液有利于牙周膜細胞功能態(tài)的維持。

ALP、Runx2是成骨樣細胞分化的早期重要標志之一[11]，其基因水平和蛋白量表達高低可衡量細胞的鈣化能力和成骨潛能。礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)牙周膜細胞，牙周膜細胞的Runx2、ALP值會升高。本研究發(fā)現(xiàn)，在與頜骨來源的骨髓基質(zhì)細胞間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)下，雖然牙周膜細胞的增殖初始受到抑制，但卻誘導(dǎo)其向成骨樣細胞分化。共培養(yǎng)第3天，牙周膜細胞的ALP水平明顯升高，但在共培養(yǎng)第7天，牙周膜細胞的ALP水平有所下降，但仍高于單純牙周膜細胞，這可能與牙周膜細胞的成骨分化機制與骨髓基質(zhì)細胞不同有關(guān)。OCN又稱C-羧基谷氨酸蛋白[12]，是成骨細胞合成和分泌的高度特異性的非膠原蛋白，細胞間液和細胞質(zhì)均可發(fā)現(xiàn)，是成骨樣細胞分化到晚期的標志。本研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)第3天，OCN蛋白水平出現(xiàn)上調(diào)。

當(dāng)然，頜骨骨髓基質(zhì)細胞對牙周膜細胞的作用還包括直接接觸、由膜蛋白介導(dǎo)[13]的交互作用等途徑，這些調(diào)控方式對牙周膜細胞的影響尚有待于進一步研究。綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)犬頜骨骨髓基質(zhì)細胞限制牙周膜細胞的增殖，促進其分化，為了解牙周膜細胞在頜骨環(huán)境中的生物學(xué)行為奠定基礎(chǔ)，但牙周膜細胞分化的確切機制尚須進一步探討。

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Inductive effects of canine maxillary bone marrow stromal cells on biological features of canine periodontal ligament cells

JINZhen-yu,LIUHong-wei

(School of Stomatology, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of canine maxillary bone marrow stromal cells (cM-BMSCs) on biological features of canine periodontal ligament cells (cPDLCs). Methods Primary cM-BMSCs were co-cultured with cPDLCs, the cell proliferation was examined by MTT method. Total mRNA and protein were extracted at d0, d3 and d7, the expression of ALP, Runx2 and OCN mRNAs was detected by qPCR; the protein levels of Runx2 and OCN were measured by Western-blotting. cM-BMSCs conditioned medium (cM-BMSCs-CM) was used to mimic the environment of maxilla and to induce the differentiation of cPDLCs. A cell sheetstrategy was chosen for the construction of periodontal tissueinvivo. Results Both cPDLCs and cM-BMSCs showed spindle-like morphology. Conditioned medium of cultured maxillary bone marrow stromal cells retarded the proliferation of cPDLCs. The expressions of ALP, Runx2 and OCN mRNAs were up-regulated in co-cultured group; and the protein levels of Runx2 and OCN in test group were higher than those in control group. cPDLCs treated by the cM-BMSCs-CM produced a cementum/PDL-like structure; however, cPDLCs alone failed to form the similar cementum/PDL-like structure in nude mice. Conclusion Conditioned medium of cM-BMSCs may hinder the proliferation of cPDLCs and promote the differentiation of cPDLCs.

maxillary bone marrow stromal cells; periodontal ligament cells; co-culture; condi-tioned medium

10.16118/j.1008-0392.2016.01.005

2015-10-15

金振宇(1984—)，男，博士研究生.E-mail： jzyaq2003@163.com

劉宏偉.E-mail： hwliu@#edu.cn

R 781.4

A

1008-0392(2016)01-0022-06