孟飛　王麗　王彥　郗林鶴　張潔

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17β雌二醇對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞膠原和彈性蛋白合成的影響

孟飛王麗王彥郗林鶴張潔

【摘要】目的探討不同濃度17β雌二醇（17β-estrogen，17β-E2）在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblast，hSFB）合成膠原及彈性蛋白的影響。方法體外培養(yǎng)hSFB，分別加入不同濃度的17β-E2（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，在不同時(shí)間點(diǎn)分別提取相應(yīng)的RNA，RT-PCR檢測(cè)經(jīng)17β-E2處理后的hSFB的Ⅰ、Ⅲ型前膠原及原彈性蛋白mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，17β-E2處理組較空白對(duì)照組前膠原及原彈性蛋白表達(dá)水平在24 h沒(méi)有變化，48 h時(shí)明顯上調(diào)，72 h時(shí)呈現(xiàn)下降；在48 h時(shí)，17β-E2對(duì)前膠原與原彈性蛋白的影響，10-10mol/L組上調(diào)作用較其他濃度組明顯；在48 h時(shí)，同一濃度17β-E2對(duì)前膠原蛋白的促進(jìn)作用較原彈性蛋白明顯，尤其是對(duì)Ⅲ型的促進(jìn)作用更強(qiáng)。結(jié)論17β-E2對(duì)膠原及彈性蛋白的合成有一定的促進(jìn)作用，不同時(shí)間、不同濃度對(duì)其影響不同，在10-10mol/l、48 h時(shí)作用最強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】17β雌二醇人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白彈性蛋白

作者單位：261000山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院（孟飛）；250014山東省濟(jì)南市山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院（孟飛，王彥，郗林鶴，張潔）；261000山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心（王麗）。

絕經(jīng)期后女性皮膚易變薄、彈性變差，皮膚中膠原及彈性蛋白流失增加，這與Ⅰ、Ⅲ型膠原比例倒置有關(guān)，是由于體內(nèi)雌激素水平下降引起。臨床上采用雌激素替代治療（Hormone replacement therapy，HRT）后，發(fā)現(xiàn)患者皮膚狀態(tài)明顯改善，皮膚增厚、彈力增加，膠原量及彈性蛋白合成增加。而分泌膠原、彈性蛋白的是真皮中的成纖維細(xì)胞，因此，我們體外培養(yǎng)hSFB，研究不同濃度17β雌二醇（17β-E2）對(duì)合成膠原及彈性蛋白的影響，以提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源

標(biāo)本取自行上瞼皮膚松弛矯正手術(shù)的絕經(jīng)后女性的上瞼皮膚標(biāo)本。

1.1.2主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原酶（索萊寶生物技術(shù)公司）；胰酶、胎牛血清、DMEM（Gibco公司）、17β雌二醇粉劑（Sigma公司）；RNA提取試劑盒（康為試劑生物有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green（臺(tái)灣東洋紡股份有限公司）。熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。1.2方法

1.2.1hSFB的分離與培養(yǎng)

皮膚標(biāo)本用含雙抗的Hanks液徹底洗凈，分離并剪碎真皮組織，用含1%的Ⅰ型膠原酶DMEM液37℃、5%CO2孵育箱消化4～6 h，200鉬篩網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，離心，含15%FBS的DMEM液重懸細(xì)胞，接種于25 cm培養(yǎng)瓶；以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞種板與藥物處理

第4代細(xì)胞接種于6孔板，設(shè)5個(gè)雌二醇濃度組（濃度分別為：10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）和1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后24 h，分別向6孔板中加入含不同濃度雌激素的15%FBS 的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。

1.2.3細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

待藥物作用24 h、48 h、72 h后，根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的總RNA，紫外線分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值及RNA濃度；將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系總體積16 μL：RT PrimerScript Buffer 4 μL，RT Enzyme 1 μL，RT Primer MIX 1 μL，無(wú)RNA酶水10 μL。RNA 4 μL 65℃變性5 min，加反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄體系16 μL后37℃15 min，98℃5 min，所得cDNA于-80℃保存。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)mRNA水平的表達(dá)

配制反應(yīng)體系，總體積10 μL：cDNA 1 μL， SYBR GREEN 5 μL，上下游引物各1 μL（表1），無(wú)菌去離子水2 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行如下：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 sec，60℃退火31 sec，72℃延伸30 sec，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)基因和GADPH mRNA水平測(cè)定，PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)GAPDH mRNA水平進(jìn)行確定。

1.2.5圖像分析與數(shù)據(jù)處理

用GAPDH為內(nèi)參照，對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原及原彈性蛋白mRNA進(jìn)行定量分析，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)17β-E2的影響

前膠原與原彈性蛋白mRNA的表達(dá)情況（圖1～3）顯示，17β-E2處理組Ⅰ、Ⅲ型前膠原及原彈性蛋白的mRNA合成，24 h時(shí)17β-E2上調(diào)作用不明顯，48 h時(shí)上調(diào)作用明顯增加，72 h時(shí)對(duì)合成的促進(jìn)作用較48 h下降。因此，我們推測(cè)，17β-E2可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌合成膠原及彈性蛋白，但作用大小可能與作用時(shí)間相關(guān)，48 h為17β-E2最佳作用時(shí)間（P＜0.05）。

2.2不同濃度17β-E2的影響

根據(jù)48 h時(shí)各組前膠原與原彈性蛋白mRNA的表達(dá)情況可以看出，一定濃度范圍內(nèi)（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），以10-10mol/L為17β-E2促進(jìn)HSFB合成Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白的最有效濃度，并且濃度大小與促進(jìn)合成作用不成正比（P＜0.05），而24 h、72 h時(shí)無(wú)此規(guī)律。

2.3同一濃度17β-E2對(duì)Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白合成的影響的比較

48 h時(shí)結(jié)果顯示，同一濃度17β-E2對(duì)Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白合成均有明顯的上調(diào)作用，但上調(diào)作用大小依次為III型前膠原、I型前膠原和原彈性蛋白，表明同一濃度17β-E2對(duì)Ⅲ型前膠原合成的調(diào)節(jié)最強(qiáng)、原彈性蛋白最弱。

表1　引物序列Table 1 Primer sequence

圖1　各組各時(shí)間點(diǎn)Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)水平Fig. 1 The mRNA expression of procollagen Ⅰin each group at different time point

圖2　各組各時(shí)間點(diǎn)Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)水平Fig. 2 The mRNA expression of procollagen Ⅲin each group at different time point

圖3　各組各時(shí)間點(diǎn)原彈性蛋白mRNA的表達(dá)水平Fig. 3 The mRNA expression of tropoelastin in each group at different time point

3　討論

女性絕經(jīng)期后，皮膚衰老加快，皮膚中膠原總含量逐漸減少，特別是可溶性膠原含量下降明顯，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例逐漸倒置；彈力纖維減少退化，膠原和彈性纖維排列漸趨紊亂；皮膚含水量漸少，出現(xiàn)干燥、松弛、變薄、皺紋形成、色素脫失或沉著等表現(xiàn)［1-3］。

臨床上治療更年期綜合征常應(yīng)用雌激素替代治療，在改善更年期癥狀的同時(shí)，患者的皮膚變好，皮膚厚度、彈性和保濕性均增加［4-6］，而雌二醇是進(jìn)行雌激素替代治療的常用藥物。成纖維細(xì)胞是雌激素作用的靶器官之一，是真皮的主體細(xì)胞，其分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質(zhì)成分，與成纖維細(xì)胞一同構(gòu)成了真皮的主體［7］。研究證明，在皺紋形成過(guò)程中，成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，其生物學(xué)特性的改變決定影響了皮膚老化程度［8］。因此，大量研究通過(guò)改善衰老皮膚的成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性，促進(jìn)膠原蛋白及彈性蛋白的增加以延緩皮膚衰老。

Sator等［9］將雌二醇外用于面部6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)治療組皮膚的濕度和彈力增加，皮膚的緊張性增加，皺紋變淺，且未見(jiàn)激素引發(fā)的不良反應(yīng)。Patriarca等［10］的研究表明，經(jīng)HRT治療后的絕經(jīng)婦女，局部應(yīng)用雌激素后面部真皮厚度及膠原數(shù)量明顯增加，而血清激素水平無(wú)明顯變化。Hosokawa等［11］應(yīng)用苯甲酸雌二醇對(duì)小鼠的成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)膠原合成，加速膠原成熟，抑制膠原降解。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入不同濃度的雌二醇與空白對(duì)照組比較。有文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素可促進(jìn)hSFB的增殖，促增殖效應(yīng)最強(qiáng)的有效濃度為10-10mol/L［12］，促進(jìn)膠原合成的最佳濃度為10-9mol/L［13］。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)不同濃度梯度（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L）進(jìn)行比較研究。另有文獻(xiàn)顯示，雌二醇對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在6 h時(shí)與對(duì)照組比較，Ⅰ型前膠原mRNA的水平幾乎無(wú)改變。因此，我們適當(dāng)延長(zhǎng)了雌二醇的作用時(shí)間，設(shè)置為3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h和72 h）［14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，17β雌二醇對(duì)膠原和彈性蛋白有一定的促進(jìn)合成作用，而且膠原的合成與雌二醇濃度不成正比，在10-10mol/L，48 h時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)。

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·論著·

Effects of 17β-estradiol on the Synthesis of Collagen and Elastin in Cultured Human Skin Fibroblasts

MENG Fei1，2，WANG Li3，WANG Yan2，XI Linhe2，ZHANG Jie2. 1 Weifang Medical University，Weifang 261000，China；2 Qianfoshan Hospital，Shandong University，Ji'nan 250014，China；3 Reproductive Center，Weifang Medical School Affiliated Hospital，Weifang 261000，China. Corresponding author: WANG Li（E-mail: wfwlstar@163.com）；WANG Yan（E-mail: wangyandr@126.com）.

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 17 beta estradiol（17β-E2）with different concentrations on the synthesis of collagen and elastin of cultured human skin fibroblasts（hSFB）at different time points in vitro. Methods Human fibroblasts were cultured with different concentrations of 17β-E2（10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）for 24 hours，48 hours and 72 hours. The corresponding RNA was extracted at respectively time points，then mRNA expression of typeⅠprocollagen，typeⅢprocollagen and tropoelastin were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method. Results The mRNA expressions of procollagenⅠ，procollagenⅢand tropoelastin were not changed in 24 hours，but up-regulated in 48 hours and declined in 72 hours by 17β-E2 stimulations. On 48 hours，the synthesis of procollagen and tropoelastin stimulated with 10－10mol/L of 17β-E2 was significantly increased，compared with the other concentrations. On 48 hours with the same concentration，the up-regulated effect on synthesis of procollagen and tropoelastin was different，the effect on procollagen was stronger than tropoelastin，especially procollagenⅢ. Conclusion17-E2 has a certain role in promoting the synthesis of collagen and elastin，though the influence is different according to different culture time and different concentration，and the most effective concentration and culture time are 10-10mol/L and 48 hours respectively.

【Key words】17β-estrogen；Human skin fibroblast；Collagen；Elastin

【中圖分類號(hào)】R622+.l

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）02－0111－03

通訊作者：王麗（E-mail：wfwlstar@163.com）；王彥（E-mail：wangyandr@126.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.006

收稿日期：（2015年12月2日；修回日期：2015年12月27日）