尹宏宇　丁榆德　劉廣鵬　曹誼林

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犬骨髓單個核細胞構建組織工程骨的體外實驗研究

尹宏宇丁榆德劉廣鵬曹誼林

【摘要】目的探索組織工程骨（Tissue Engineered Bone，TEB）的即刻構建方案，以符合臨床骨缺損即刻修復的要求。方法分離獲取Beagle犬骨髓單個核細胞（Canine bone marrow mononuclear cells，cBMNCs）。將密度為30×106cells/mL 的cBMNCs復合部分脫鈣骨（Partially demineralized bone matrix，pDBM）即刻構建TEB。對即刻構建的TEB進行體外培養(yǎng)和成骨檢測。結果在成骨誘導的體外培養(yǎng)環(huán)境下，即刻構建的TEB具有一定的細胞活性和成骨能力。結論即刻構建的TEB可直接回植，以滿足體內(nèi)即刻骨缺損修復的要求。

【關鍵詞】組織工程骨骨髓單個核細胞骨髓基質(zhì)干細胞

作者單位：100144北京市中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院頜面整形外科中心（尹宏宇，丁榆德）；200072上海市上海市第十人民醫(yī)院整形外科（劉廣鵬）；100144北京市中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院（曹誼林）。

種子細胞是骨組織工程研究領域中的關鍵點。骨髓基質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）與其他骨源細胞相比，獲取方法簡便可靠，創(chuàng)傷較小，且體外培養(yǎng)可獲得大量擴增的細胞。將BMSCs誘導為成骨細胞進行組織工程骨（Tissue Engineered Bone，TEB）的構建，已成為骨組織工程的研究熱點［1］。但BMSCs復合材料構建TEB的常規(guī)體外構建方案一般需要3周時間，難以滿足臨床上即刻骨缺損修復的需要。因此，本實驗通過骨髓單個核細胞（Bone marrow mononuclear cells，BMNCs）復合材料即刻構建TEB，并在成骨誘導環(huán)境下進行體外檢測，以觀察該方案應用于臨床骨缺損即刻修復的可行性。

1　材料和方法

1.1材料

2歲齡Beagle犬6條（上海農(nóng)學院），雌雄不限，體質(zhì)量約20 Kg。

試劑（Sigma公司，美國）：Percoll原液（77237 Percoll）；DNA試劑盒；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色劑；骨鈣蛋白（Osteocalcin，OCN）染色劑。

1.2方法

1.2.1犬骨髓單個核細胞（Canine bone marrow mononuclear cells，cBMNCs）的分離提純

抽取實驗犬骨髓2.5 mL，參照文獻［2］的方法，進行Percoll液配制和cBMNCs分離提純。

1.2.2支架材料的準備

部分脫鈣骨（Partially demineralized bone matrix，pDBM）取材于豬的股骨頭松質(zhì)骨，制備過程參照文獻［3］。pDBM支架材料的孔徑為（330.5±33.6）μm；孔隙率為（80.05%±3.92%）；余留鈣量為（19.0%±1.6%）。將pDBM加工成直徑5 mm，厚1 mm的圓盤狀。

1.2.3cBMNCs在pDBM上的黏附率

參照文獻［4］的方法，分離獲取的cBMNCs直接以10×106cells/mL、20×106cells/mL、30×106cells/mL、40×106cells/mL、50×106cells/mL、60×106cells/mL和70×106cells/mL的密度，分別接種于pDBM上，每個細胞密度各接種5塊材料。將細胞材料復合物在培養(yǎng)箱中放置4 h后，換另一培養(yǎng)皿。將原培養(yǎng)皿中的細胞進行消化收集，血球計數(shù)板計算出未黏附的細胞數(shù)。

細胞黏附率=（接種的細胞數(shù)-未黏附的細胞）/接種的細胞數(shù)

1.2.4TEB的制備

分離獲取10 mL的Beagle犬骨髓cBMNCs，根據(jù)黏附率的測定結果，選取最佳的細胞密度重懸成細胞懸液，并直接接種于pDBM支架材料來即刻構建TEB。

1.2.5TEB細胞活性的體外檢測

將cBMNCs復合pDBM即刻構建的TEB體外成骨誘導培養(yǎng)32 d，以各自培養(yǎng)8 d的成骨誘導和未誘導的第2代cBMSCs復合pDBM常規(guī)構建TEB，再分別進行體外成骨誘導培養(yǎng)24 d［3］。從接種pDBM的次日起的第1、4、8、16、24和32天，用DNA定量檢測法檢測3種細胞在材料上各自的增殖情況（以單純pDBM作為空白對照）。

1.2.6TEB ALP活性和OCN活性的體外檢測［5］

檢測時間點同1.2.5，測定3種細胞在材料上各自的ALP表達和OCN沉積。

1.2.7統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以Excel軟件處理，行t檢驗。每個檢測樣本重復3次，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，P＜0.05為差異顯著。

2　結果

2.1cBMNCs在pDBM支架材料上的黏附率

cBMNCs的細胞接種密度從10×106cells/mL到 30×106cells/mL時，隨著密度的增加，pDBM上的黏附率逐漸增大。之后細胞密度從40×106cells/mL增加至70×106cells/mL，但黏附率卻持續(xù)走低，提示細胞在pDBM上已過于飽和。原因可能是cBMNCs中除可貼壁細胞外還有較多其他的雜細胞，隨著細胞密度的增加，貼壁細胞中混雜的不貼壁細胞數(shù)量更多，從而影響和干擾了cBMNCs在材料上的黏附，導致黏附率下降。因此，我們認為30×106cells/mL是cBMNCs復合pDBM的最佳接種密度（圖1）。

圖1　cBMNCs在pDBM上的黏附率Fig. 1 The adhesion rate of cBMNCs on pDBM

2.2TEB細胞活性的體外檢測

同樣的培養(yǎng)時間內(nèi)，第2代成骨誘導cBMSCs數(shù)量是第2代未成骨誘導cBMSCs的1.6倍。因此，成骨誘導和未誘導cBMSCs接種pDBM的密度是不同的，導致接種第1天成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物的細胞量是（0.64±0.08）×106cells/mL，而未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物是（0.40±0.07）×106cells/mL。兩者經(jīng)過3 d的潛伏適應期后，從第4天開始進入了為期5 d的對數(shù)增殖期。盡管第8天后都開始成骨誘導，但由于細胞開始進入平臺期，增速顯著變緩。在成骨誘導和未誘導cBMSCs-pDBM復合物體外培養(yǎng)的第32天（即cBMNCs-pDBM復合物成骨誘導的第24天）檢測的細胞量比較顯示，成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物＞未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物＞cBMNCs-pDBM復合物（P＜0.05）（圖2）。

圖2　cBMNCs-pDBM復合物、第2代成骨誘導和未誘導cBMSCs-pDBM模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下體外培養(yǎng)的細胞活性檢測Fig. 2 The growth curves of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

2.3TEB ALP活性的體外檢測

第2代成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物的ALP表達在32 d的體外培養(yǎng)時間內(nèi)保持持續(xù)增加，尤其從接種第4天起增速明顯加快，與2.2的檢測結果相似。而第2代未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物在8 d的無誘導培養(yǎng)環(huán)境下幾乎沒有ALP表達，cBMNCs-pDBM復合物的ALP表達在體外培養(yǎng)的32 d內(nèi)也保持持續(xù)增加，但第1周的增速很慢，之后增速才加快。盡管在成骨誘導和未誘導cBMSCspDBM復合物體外培養(yǎng)的第32天，檢測成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物的ALP表達（15.65±1.58 μmol PNP/min·106cells）是cBMNCs-pDBM復合物（6.18±1.49 μmol PNP/min·106cells）的2.5倍，但隨著體外培養(yǎng)時間的延長，cBMNCs-pDBM復合物的ALP表達仍繼續(xù)保持8 d的快速增加，在第32天時達到了（8.87±1.35 μmol PNP/min·106cells），并接近未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物第32天時的（9.19±2.64 μmol PNP/min·106cells），可見其具有很大的成骨潛能（圖3）。

圖3　cBMNCs-pDBM復合物、第2代成骨誘導和未誘導cBMSCs-pDBM復合物在模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下進行體外培養(yǎng)的ALP檢測Fig. 3 The ALP activity of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

圖4　cBMNCs-pDBM復合物、第2代成骨誘導和未誘導cBMSCs-pDBM復合物在模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下進行體外培養(yǎng)的OCN檢測Fig. 4 The OCN activity of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

2.4TEB OCN活性的體外檢測

第2代成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物和第2代未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物的OCN沉積在體外培養(yǎng)的32 d內(nèi)的變化趨勢類似于ALP定量檢測結果。而cBMNCs-pDBM復合物的OCN沉積卻出現(xiàn)2周的慢速增加，之后增速才加快。第32天檢測OCN沉積，成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物（3.32±0.32 ng/106cells）是cBMNCs-pDBM復合物（0.86±0.49 ng/106cells）的近4倍，但隨著體外培養(yǎng)時間的延長，cBMNCs-pDBM復合物的OCN沉積仍保持8 d的快速增加，達到（1.26±0.32 ng/106cells），并接近未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物32 d時的（1.37±0.47 ng/106cells），同樣證明其巨大的成骨潛能（圖4）。

3　討論

骨組織感染、骨不連、嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除，以及先天性畸形所造成的大塊骨組織缺損，移植是臨床修復的難點。TEB克服了自體和異體骨移植所存在的問題，是目前最有發(fā)展前景的骨修復方法［6］。種子細胞是構建TEB的重點之一。BMSCs來源穩(wěn)定可靠，具有非常強的擴增、再生能力［7］，而且獲取骨髓的創(chuàng)傷相對較小，可反復抽取，多次取材，因此BMSCs是目前用于構建TEB的主要的種子細胞［8-9］。

BMSCs來源于BMNCs，而BMNCs是由單核前體細胞分化形成，單核前體細胞又是通過骨髓中大量未成熟的成單核細胞分化產(chǎn)生。新形成的BMNCs在骨髓中只短暫停留，24 h內(nèi)即離開骨髓進入循環(huán)系統(tǒng)，在外周血停留約8 h后遷移至各組織中，并直接轉(zhuǎn)化成巨噬細胞。單核前體細胞大小為12～18 μm，通常為圓形，細胞核不規(guī)則，可形成貼壁，約占骨髓細胞的3%。而BMNCs大小為12～15 μm，呈凹陷形，可緩慢移動，具有很強的貼壁能力［10-11］。

為解決臨床即刻骨缺損修復的難題，有研究認為可將BMNCs作為種子細胞復合材料即刻構建TEB來直接回植。盡管已有體內(nèi)實驗證明此方案具有可行性，但無相關體外實驗支持。因此，本實驗通過在成骨誘導環(huán)境下對其進行細胞活性和成骨能力的體外檢測來進一步加以驗證。

前期研究顯示，cBMSCs經(jīng)體外成骨誘導后能大量擴增，第2代cBMSCs具有良好的成骨活性，并已找出復合pDBM適宜的體外培養(yǎng)天數(shù)為8 d［5］。本實驗通過黏附率的檢測獲得了cBMNCs接種pDBM的最佳密度為30×106cells/mL。因此，將此濃度的cBMNCs復合pDBM即刻構建的TEB作為實驗組。為了實現(xiàn)體外檢測的可靠性，我們采用成骨誘導培養(yǎng)液作為體外培養(yǎng)環(huán)境。將第2代成骨誘導和未誘導cBMSCs-pDBM復合物先各自體外培養(yǎng)8 d，再與cBMNCs-pDBM復合物分別用成骨誘導培養(yǎng)液一起進行體外成骨誘導培養(yǎng)，并將cBMNCs-pDBM復合物再繼續(xù)延長8 d的成骨培養(yǎng)，以驗證其細胞生長與成骨分化的潛能。實驗結果顯示，在24 d的模擬體內(nèi)成骨環(huán)境中，無論是細胞活性還是成骨能力，成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物＞未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物＞cBMNCs-pDBM復合物，但隨著體外培養(yǎng)時間的延長，cBMNCs-pDBM復合物的細胞增殖能力和成骨活性仍繼續(xù)保持8 d的快速增加，接近未成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物32 d時的檢測結果，與成骨誘導cBMSCs-pDBM復合物之間的差距也進一步縮小，可見若繼續(xù)培養(yǎng)，cBMNCs-pDBM復合物仍有明顯的提升空間。

總之，本實驗通過成骨誘導環(huán)境下的體外檢測，進一步證明了從犬骨髓中分離獲取的cBMNCs不經(jīng)過培養(yǎng)而直接復合pDBM支架材料即刻構建TEB，在同樣無體外培養(yǎng)的情況下立即用于體內(nèi)骨缺損修復的方案具有可行性。

參考文獻

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Experimental Study of Constructing Tissue Engineered Bone with Canine Bone Marrow Mononuclear Cells in Vitro

YIN Hongyu1，DING Yude1，LIU Guangpeng2，CAO Yilin3. 1 Department of Maxillofacial Surgery，Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China；2 Department of Plastic Surgery，Shanghai Tenth People's Hospital，Shanghai 200072，China；3 Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China. Corresponding author: CAO Yilin（E-mail: yilincao@yahoo.com）.

【Abstract】Objective To explore a method for instantly constructed TEB to meet the instantly clinical requirements of repairing bone defects. Methods BMNCs of Beagle were separated by 1.063 g/mL Percoll gradient solution. The ideal seeding density of 30×106cells/mL was obtained for canine bone marrow mononuclear cells（cBMNCs）on partially demineralized bone matrix（pDBM）. The cell activity and osteogenic capacity of immediately constructed TEB composed of cBMNCs and pDBM were analyzed in vitro. ResultsCertain cell activity and osteogenic capacity were confirmed in immediately constructed TEB under the osteogenically inducted environment in vitro. Conclusion The directly replantation of instantly constructed TEB might satisfy the immediately clinical requirements of repairing bone defects.

【Key words】Tissue engineered bone；Bone marrow mononuclear cells；Bone marrow mesenchymal stem cells

【中圖分類號】Q813.1+2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）02－0094－04

通訊作者：曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.002

收稿日期：（2015年12月21日；修回日期：2015年2月25日）