郭秀麗，許光宇，秦丹丹，白雅竹，任秋穎，鄭林萍*

(1.河南大學 藥學院，河南 開封 475004；　2.開封市衛(wèi)生學校，河南 開封 475002；3.河南大學 民生學院，河南 開封 475004)

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環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球的制備及其負載多柔比星體外釋放的研究

郭秀麗1，許光宇2，秦丹丹3，白雅竹3，任秋穎3，鄭林萍1*

(1.河南大學 藥學院，河南 開封 475004；2.開封市衛(wèi)生學校，河南 開封 475002；3.河南大學 民生學院，河南 開封 475004)

摘要：采用檸檬酸鈉作為穩(wěn)定劑，通過超聲輔助水相共沉淀法合成了檸檬酸修飾的Fe3O4納米粒(Fe3O4@CA)，進一步采用真空干燥法制備了β-環(huán)糊精包覆的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD). 分別利用X射線粉末衍射儀、傅立葉變換紅外光譜儀、透射電子顯微鏡、熱重分析儀等表征手段對其進行了結構和形貌表征. 同時，以多柔比星為模型藥物,考察了Fe3O4@β-CD微球對多柔比星的體外釋放行為. 結果表明，F(xiàn)e3O4@CA納米粒子呈球形或類球形，平均流體力學直徑為84 nm，具有順磁性，室溫下飽和磁化強度為17.5 emu·g-1，紅外光譜結果表明，β-環(huán)糊精成功的包覆在Fe3O4@CA表面，F(xiàn)e3O4@β-CD的平均流體力學直徑為104 nm，室溫下飽和磁化強度為15.7 emu·g-1. 體外釋放結果表明，F(xiàn)e3O4@β-CD-DOX載藥系統(tǒng)在PBS(pH=7.4)溶液中釋放緩慢，12 h累積釋放率為45.5%. 結果表明，環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球在體外有明顯的緩釋效果，有望成為理想的抗腫瘤藥物載體.

關鍵詞：Fe3O4；β-環(huán)糊精；多柔比星；體外釋放

磁性Fe3O4納米粒作為一種新型磁性納米材料，因具有良好的生物相容性、生物可降解性、在外磁場作用下能實現(xiàn)靶向治療等優(yōu)點，廣泛應用于生物醫(yī)學工程等領域，如磁共振成像[1-2]、催化劑[3]、磁流體材料[4]、基因轉導[5]、生物細胞富集和分離[6]、靶向藥物傳遞[7-8]、腫瘤熱療[9]等領域. 目前，合成Fe3O4工藝有很多，如水相共沉淀法、微乳液法、熱分解法、溶膠-凝膠法等. 如何找到一條能有效控制納米粒的形貌、粒徑大小與分布的合成方法，是當前研究的熱點. 由于Fe3O4納米粒表面積較大，容易發(fā)生團聚，因此需要在Fe3O4表面進行修飾以提高其穩(wěn)定性. 其中研究較多的是在水相中加入表面活性劑以提高納米粒子的分散性. 常用的表面活性劑有聚乙二醇(PEG)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、油酸鈉(Sodium oleate)等.

當Fe3O4納米粒子用于靶向治療藥物的載體時存在一些問題，如載藥率低、藥物釋放存在明顯突釋現(xiàn)象等.β-環(huán)糊精作為一種常用的包合材料，是具有7個葡萄糖單元的環(huán)狀聚合物，具有能容納疏水性藥物的空穴結構，其自身毒性很低，適用于提高疏水性藥物的水溶性或者延緩藥物釋放，是一種比較理想的藥物載體. 在醫(yī)藥和食品行業(yè)等領域中，環(huán)糊精已經(jīng)得到了廣泛應用[10-11]. 我們首先以超聲輔助水相共沉淀法制備Fe3O4納米粒，在控制其形貌、粒徑尺寸與分布及磁性能的基礎上，用生物相溶性好且?guī)в卸喙倌軋F的檸檬酸修飾Fe3O4納米粒表面，然后進一步與β-環(huán)糊精偶聯(lián)，制備了β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球，最后以多柔比星為模型藥物考察了Fe3O4@β-CD微球對多柔比星的負載及體外釋放行為.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

六水合三氯化鐵、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、檸檬酸、無水乙醇(天津科密歐化學試劑有限公司)；β-環(huán)糊精、PBS(阿拉丁試劑公司)；鹽酸多柔比星(DOX·HCl，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；實驗用水為去離子水；其他試劑均為分析純.

DF-101S型磁力攪拌水浴鍋(河南國瑞儀器有限公司)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；D8 ADVANCE型X射線粉末衍射儀(美國Bruker公司)；VERTEX 70型傅立葉變換紅外光譜儀(美國Bruker公司)；SDTA851e型熱重分析儀(瑞士Mettler-Toledo公司)；Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；ZetasizerNano ZS 90型激光粒度及Zeta電位儀(英國Malvern公司)；MPMS-XL-7型超導量子干涉儀(美國Quantum Design公司)；7200型紫外-可見光譜儀(美國Unico公司).

1.2檸檬酸修飾Fe3O4納米粒的制備

分別取一定量的FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O溶解于去離子水中，攪拌使其完全溶解，得到n(Fe3+)∶n(Fe2+)=2∶1的黃綠色鐵鹽溶液，記為溶液A. 另取一定量氫氧化鈉和檸檬酸溶解于去離子水中，攪拌使其完全溶解，記為溶液B. 將溶液B加到250 mL三口瓶中，在超聲攪拌條件下，將溶液A逐滴加入溶液B中，60 ℃下繼續(xù)反應30 min，利用外加磁場收集產(chǎn)物，然后用去離子水和無水乙醇交替洗滌3次，60 ℃下真空干燥24 h，得到檸檬酸修飾的Fe3O4納米粒(Fe3O4@CA).

1.3環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球的制備

稱取Fe3O4@CA 1.0 g，加去離子水1.5 mL，再加入β-環(huán)糊精2.0 g，混合均勻后放入真空干燥箱中，在110 ℃下真空干燥3 h. 干燥后的樣品用無水乙醇和去離子水反復洗3遍，用磁鐵分離最終產(chǎn)物，在60 ℃下真空干燥24 h，制得β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD).

1.4樣品表征

利用X射線衍射儀檢測樣品的X射線粉末衍射(XRD)；利用傅立葉變換紅外光譜儀,溴化鉀壓片測試樣品的紅外光譜(FT-IR)；采用透射電子顯微鏡觀察樣品的形貌，操作條件為200 kV；采用激光納米力度儀檢測樣品的粒徑及分布；采用熱重分析儀測試樣品的熱穩(wěn)定性，測試條件：升溫速度10 ℃·min-1，溫度范圍為20～800 ℃；采用超導量子干涉儀測定樣品的磁性能;使用紫外-可見光譜儀測試樣品的紫外吸收光譜.

1.5多柔比星的負載與體外釋放

將10 mg Fe3O4@β-CD分散于0.1 g·L-1多柔比星的PBS溶液中，用超聲儀處理(70 kHz，300 W)，處理時間分別為10、20、30、60、90 min. 將混懸液高速離心(8 000 r·min-1)5 min，測上清液紫外吸收，根據(jù)標準曲線確定上清液中多柔比星的濃度，最后確定最佳超聲時間、載藥量及包封率. 將離心分離得到的Fe3O4@β-CD-DOX用去離子水洗2遍后冷凍干燥，置于冰箱中密封保存. 載藥量和包封率的計算公式如下：

精密稱Fe3O4@β-CD-DOX 10 mg，加20 mL去離子水超聲分散后裝入透析袋中(截留摩爾質量14 000 g·mol-1)，放入80 mL PBS(pH=7.4)緩沖液中，水浴溫度37 ℃，開動磁力攪拌，每隔一段時間取2 mL溶液測紫外吸收，同時補充2 mL 新鮮的PBS緩沖液. 通過測定所取的緩沖溶液中DOX的紫外吸收可以計算出不同時間的釋藥率.

2結果與討論

2.1表征

圖1為Fe3O4@CA的XRD圖. 從衍射譜圖看，峰的位置、強度與粉末衍射PDF卡(JCPDS NO.82-1533)上的Fe3O4標準數(shù)據(jù)基本吻合，2θ=30.26°、35.61°、43.64°、53.91°、57.33°、62.84°處的6個明顯衍射峰分別對應于(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)的6個晶面，這表明通過改進化學共沉淀法制備所得的產(chǎn)物為Fe3O4納米粒子，并具有立方晶系結構.

圖1　Fe3O4@CA的XRD圖Fig.1　XRD pattern of Fe3O4@CA

圖2分別為純Fe3O4、檸檬酸、Fe3O4@CA的紅外光譜圖. a曲線中586 cm-1處出現(xiàn)了Fe3O4特征吸收峰，3 416 cm-1為Fe3O4所含少量結晶水的吸收峰. b曲線中1 394、1 593 cm-1為羰基的碳氧振動吸收峰，3 455 cm-1為檸檬酸中羥基的氫氧伸縮振動吸收峰. c曲線1 148 cm-1是檸檬酸的羧基與Fe3O4表面羥基鍵合形成的酯鍵的振動吸收峰. 從紅外譜圖可以進一步證明檸檬酸分子修飾在Fe3O4納米粒表面.

圖2　純Fe3O4(a)、檸檬酸(b)、Fe3O4@CA(c)的紅外光譜圖Fig.2　FT-IR spectra of pure Fe3O4(a),citric acid(b), and Fe3O4@CA(c)

圖3分別為Fe3O4@CA(a)、β-CD(b)、Fe3O4@β-CD(c)的紅外光譜圖. b曲線1 029、1 159、2 927 cm-13個峰為β-環(huán)糊精特征吸收峰. c曲線中在1 030、2 924 cm-1出現(xiàn)了β-環(huán)糊精的特征吸收峰，1 154、1 590 cm-1出現(xiàn)了檸檬酸的特征吸收峰，說明β-環(huán)糊精的羥基與Fe3O4@CA的游離羧基形成了化學鍵，β-環(huán)糊精成功的包覆在Fe3O4@CA表面.

圖3　Fe3O4@CA(a)、β-CD(b)、Fe3O4@β-CD(c)的紅外光譜圖Fig.3　FT-IR spectra of Fe3O4@CA(a),β-CD(b), and Fe3O4@β-CD(c)

圖4為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的透射電鏡圖. 如圖a所示，F(xiàn)e3O4@CA納米粒子近似呈球形，單個納米粒子粒徑平均在12 nm左右，納米粒子呈簇集狀態(tài)，平均簇徑為80 nm左右. 從圖b可以看出，F(xiàn)e3O4@β-CD近似呈球性，分散較為均勻，平均簇徑為100 nm左右.

圖4　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的透射電鏡圖Fig.4　TEM images of Fe3O4@CA(a) and Fe3O4@β-CD(b)

圖5為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的熱失重曲線. 從圖上可以看出，曲線a中從室溫到120 ℃累計失重為2.4%，是由于樣品中含有的水受熱蒸發(fā). 當加熱到400 ℃時，累計失重達到14.5%，由檸檬酸高溫下分解造成. 400 ℃以后重量不再損失，說明檸檬酸已完全分解. 曲線b中從室溫到120 ℃累計失重為3.3%，是由于樣品中所含結晶水蒸發(fā). 當加熱到800 ℃時，累計失重為32.2%. 經(jīng)查詢Scifinder數(shù)據(jù)庫，β-環(huán)糊精的熔點是293～294 ℃，在該溫度下同時發(fā)生分解. b曲線是檸檬酸和β-環(huán)糊精先后發(fā)生分解形成的曲線. 熱失重測試結果表明β-環(huán)糊精連接在Fe3O4@CA納米粒上，與紅外結論一致.

圖6分別為Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的平均流體力學直徑分布圖. 動態(tài)光散射法測得Fe3O4@CA納米粒子的平均流體力學直徑為84 nm，PDI(多分散指數(shù))=0.194. Fe3O4@CA的Zeta電位為-40.2 mV，其絕對值大于25 mV，意味著其表面靜電斥力能抵消相鄰微粒間的引力，從而表明Fe3O4@CA納米粒子在堿性溶液中能穩(wěn)定存在. Fe3O4@β-CD的平均流體力學直徑為104 nm，多分散指數(shù)(PDI)=0.199，相比Fe3O4@CA，其平均流體力學直徑增大20 nm.

圖5　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的熱失重曲線Fig.5　TGA curves of Fe3O4@CA (a) and Fe3O4@β-CD(b)

圖6　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的平均流體力學直徑分布圖Fig.6　Size distribution of Fe3O4@CA(a) and Fe3O4@β-CD(b)

從圖7可見，當外加磁場的強度變?yōu)榱愕臅r候，樣品的磁化強度也變?yōu)榱?，且無剩磁. 并且在整個外加磁場的變化過程中(-20～20 kOe)沒有明顯的磁滯回環(huán)，說明Fe3O4@CA和Fe3O4@β-CD都具有順磁性，飽和磁化強度Ms分別為17.5、15.7 emu·g-1. 與Fe3O4@CA相比，F(xiàn)e3O4@β-CD飽和磁化強度略有降低，原因是Fe3O4@β-CD微球中Fe3O4相對含量較少.

圖7　Fe3O4@CA(a)和Fe3O4@β-CD(b)的磁滯曲線(T=300 K)Fig.7　Magnetization curves of Fe3O4@CA(a)and Fe3O4@β-CD(b)(T=300 K)

2.2藥物的負載與釋放性能研究

為了研究復合納米微球的載藥和釋藥性質,我們選用一種經(jīng)典的抗癌藥物DOX作為模型藥物. 通過超聲實驗把DOX載入復合納米粒子Fe3O4@β-CD中,確定最佳超聲時間為30 min，所測的載藥量為12%，藥物包封率為30%.

如圖8所示，F(xiàn)e3O4@β-CD-DOX載藥系統(tǒng)在PBS(pH=7.4)溶液中釋放緩慢，12 h累積釋放率45.5%，說明該復合納米微球具有緩釋效果.

圖8　Fe3O4@β-CD-DOX體外釋放曲線Fig.8　In vitro release profile of Fe3O4@β-CD-DOX

3結論

以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O為鐵源，NaOH為堿源,檸檬酸為穩(wěn)定劑，采用超聲輔助水相共沉淀法制備了Fe3O4@CA納米粒. 采用真空干燥法合成了β-環(huán)糊精改性的Fe3O4納米微球(Fe3O4@β-CD)，紅外光譜結果表明β-環(huán)糊精成功包覆在Fe3O4@CA表面，激光粒度儀測得其粒徑比Fe3O4@CA稍偏大，磁強計測得其飽和磁化強度略有降低，原因是Fe3O4@β-CD微球中Fe3O4相對含量較少. 體外釋放實驗表明環(huán)糊精改性Fe3O4納米微球有明顯的緩釋效果，有望成為理想的抗腫瘤藥物載體.

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[責任編輯：張普玉]

收稿日期：2016-02-26.

基金項目：省教育廳科學技術研究重點項目(14A350009)，河南大學民生學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)支持計劃項目(MSCXCY2015054).

作者簡介：郭秀麗(1989-)，女，碩士生，研究方向為新型藥物制劑. *通訊聯(lián)系人，E-mail: zhenglinping2006@126.com.

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0364-05

Preparation and in vitro release study of doxorubicin-loaded cyclodextrin modified Fe3O4nanospheres

GUO Xiuli1, XU Guangyu2, QIN Dandan3, BAI Yazhu3, REN Qiuying3, ZHENG Linping1*

(1.CollegeofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China;2.KaifengHealthSchool，Kaifeng475002,Henan,China;3.MinshengCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract:Fe3O4@CA nanoparticles were successfully synthesized by ultrasound-assisted coprecipitation method with citric acid as a stabilizer, and Fe3O4@β-CD nanospheres were prepared by vacuum drying. Their structure and morphology were characterized by X-ray powder diffraction, fourier-transform infrared spectroscopy, transmission electron microscopy, thermogravimetric analyzer and other characterization methods.At the same time, the in vitro release behavior of Fe3O4@β-CD microspheres to doxorubicin was investigated using doxorubicin as a model drug. Results showed that Fe3O4@CA nanoparticles were spherical or spherical like, the average hydrodynamic diameter was 84 nm,and the saturation magnetization was 17.5 emu·g-1at room temperature. Fourier-transform infrared spectroscopy results show that β-CD and Fe3O4@CA were successfully coupled and the average hydrodynamic diameter was 104 nm, magnetic properties test showed that the magnetic microspheres saturation magnetization was

15.7 emu·g-1. In vitro release studies showed that the release rate of Fe3O4@β-CD-DOX drug loading system in PBS (pH=7.4) solution was slow, and the cumulative release rate of 12 h was 45.5%. Results show that cyclodextrin modified Fe3O4microspheres have obvious sustained-release effect in vitro. It is a potential drug carrier for the delivery of antitumor drugs.

Keywords:Fe3O4; β-cyclodextrin; doxorubicin; in vitro releasation