封　聰，霍韜光，王守云，張穎花，吳　輝，姜　泓*

(1.中國醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，遼寧 沈陽 110122；　2. 中國醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110122)

?

LC-MS/MS 測定小鼠腎臟中甘草次酸的含量

封聰1，霍韜光1，王守云2，張穎花1，吳輝1，姜泓1*

(1.中國醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，遼寧 沈陽 110122；2. 中國醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110122)

摘要：建立LC-MS/MS測定小鼠腎臟中甘草次酸含量的方法. 本法以原兒茶酸為內(nèi)標物質(zhì)，采用多反應監(jiān)測模式，對腎臟中甘草次酸進行定量研究. 結(jié)果所建方法靈敏、精確、快速、線性范圍寬，可用于甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥小鼠腎臟中甘草次酸的含量測定.

關(guān)鍵詞：液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；甘草次酸；原兒茶酸；含量測定

甘草次酸(glycyrrhetinic acid)是甘草的主要有效成分甘草酸及其鹽(即甘草甜素)的代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護肝細胞、抗氧化及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，具有明顯增強肝腎的解毒功能和腦保護作用[1-3]. 近年來，對生物樣品中甘草次酸含量測定方法的研究時有報道，但多集中在對血漿樣品中甘草次酸含量測定上[4-6]，而有關(guān)組織樣品中測定甘草次酸含量的方法少有報道. 本研究將采用二級質(zhì)譜掃描的方法對腎臟中甘草次酸進行定量分析，并首次選用原兒茶酸作為內(nèi)標物質(zhì)，建立LC-MS/MS測定小鼠腎臟中甘草次酸含量的方法. 并將該法應用于甘草次酸對雄黃解毒的研究中，為甘草與雄黃配伍機制的研究提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù).

1實驗部分

1.1儀器與試劑

1290液相色譜-6420 三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國，Agilent)，ER-182A全自動電子天平(十萬分之一) (日本A&D公司)；3K-18型超速低溫冷凍離心機(Sigma公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)；Easypure純水系統(tǒng)(美國，Barnstead公司).

甘草次酸(上海源葉生物科技有限公司)，原兒茶酸(中國藥品生物制品檢定所，809-9201)，甲醇(質(zhì)譜純，美國Sigma公司)，乙腈(質(zhì)譜純，美國Sigma公司).

1.2實驗方法

1.2.1甘草次酸標準系列溶液和內(nèi)標溶液的配制

精密稱取甘草次酸對照品適量，用甲醇溶解，得濃度為322.6 mg/L的甘草次酸儲備液. 精密量取儲備液適量，配成濃度為67.20、134.4、336.0、672.0、1 344、6 720 μg/L的系列標準對照溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

精密稱取原兒茶酸適量，用甲醇溶解，得濃度為920.0 μg/L的原兒茶酸儲備液. 臨用前精密量取儲備液適量，用甲醇稀釋成濃度為184.0 μg/L溶液，作為內(nèi)標溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2色譜條件和質(zhì)譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(Agilent 4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈-水(體積比80∶20)，流速為1 mL/min，進樣量10 μL.

電噴霧(ESI)離子源，負離子模式，掃描方式為多反應檢測(MRM)，甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸m/z為153.1→109.1. 毛細管電壓為3 500 V，離子源溫度為330 ℃，甘草次酸和原兒茶酸的毛細管出口電壓分別為200 V和100 V，碰撞電壓(CE)分別為38 V和15 V；保護氣流量10 L/min.

1.2.3樣品溶液的制備

精密稱取腎臟組織200 mg，加入乙腈1.0 mL，超聲破碎2 min，然后加入濃度為184 μg/L的原兒茶酸內(nèi)標溶液200 μL，混勻，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)10 min. 取上清液，濃縮至干，殘渣以50 μL乙腈-水(體積比80∶20)復溶，離心5 min (4 ℃，12 000 r·min-1)，取上清液進樣分析.

1.2.4應用

SPF級雄性ICR小鼠50只，體重(20±2) g，均由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供，標準飼料喂養(yǎng)，小鼠自由攝食及飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)1 w. 按照體重隨機分為5組，每組10只. 第1組為對照組，灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液；第2組為雄黃對照組，灌胃給予雄黃1.35 g/kg；第3組為甘草次酸對照組，灌胃給予甘草次酸48 mg/kg；第4組為甘草次酸干預低劑量組灌胃給予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)；第5組為甘草次酸干預高劑量組灌胃給予甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg). 每日灌胃1次，連續(xù)8 w. 每隔3 d稱量體重1次，調(diào)節(jié)灌胃容量. 于末次給藥24 h后，無水乙醚麻醉，冰浴取小鼠腎臟組織，用冷0.9%生理鹽水沖洗干凈，待用.

1.3方法學考察

1.3.1專屬性

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加內(nèi)標物質(zhì)，按“1.2.3”項下依法操作；將一定濃度的甘草次酸和內(nèi)標溶液加入混合腎組織勻漿液中，依同法操作；取雄黃對照組、甘草次酸對照組、甘草次酸聯(lián)合用藥低劑量組和聯(lián)合用藥高劑量組大鼠腎組織樣品，依同法操作，進樣10 μL，得色譜圖.

1.3.2線性范圍和標準曲線

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，分別加入甘草次酸系列對照品溶液和內(nèi)標溶液各200 μL，得濃度為9.600、19.20、48.00、96.00、192.0、960.0 μg/L的甘草次酸腎組織樣品，按“1.2.3”項操作處理，制備標準曲線. 以甘草次酸和內(nèi)標物色譜峰面積比值為縱坐標，以甘草次酸濃度為橫坐標，采用加權(quán)最小二乘法線性回歸，求得回歸方程.

1.3.3精密度和準確度

按“1.3.2”項下操作，制備甘草次酸低、中、高三個濃度(50.00、250.0、800.0 μg/L)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度樣本平行制備5份，重復三個分析批，連續(xù)測定3 d，并與標準曲線同批測定，以當日的標準曲線計算QC樣品的測定濃度，與配制的濃度對照，求得精密度和準確度.

1.3.4提取回收率

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，按“1.3.2”項下操作，制備甘草次酸低、中、高三個濃度(50、250、800 μg/L)的QC樣品，每一濃度樣本平行制備5份；另取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加系列標準溶液和內(nèi)標外，按“1.3.2”項下操作，向獲得的殘渣中加入內(nèi)標溶液和相應濃度的標準系列溶液各200 μL，渦旋混合，濃縮至干，殘渣用50 μL乙腈-水(體積比80∶20)復溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進樣分析，獲得峰面積，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比計算甘草次酸和內(nèi)標的提取回收率.

1.3.5樣品穩(wěn)定性

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，按“1.3.2”項下操作，制備甘草次酸低、中、高三個濃度(50、250、800 μg/L)的QC樣品，每一濃度樣本平行制備5份，分別考察樣品經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)后(-20到20 ℃)、室溫放置24 h及-20 ℃儲存30 d的穩(wěn)定性.

1.3.6基質(zhì)效應

取6只對照組小鼠混合腎組織勻漿液，除不加系列標準溶液和內(nèi)標外，按“1.3.2”項下操作，向獲得的殘渣中加入內(nèi)標溶液和相應濃度的標準系列溶液各200 μL，渦旋混合，濃縮至干，殘渣用50 μL乙腈-水(體積比80∶20)復溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進樣分析. 另精密吸取低、中、高三個濃度的甘草次酸對照品溶液200 μL，加入內(nèi)標溶液200 μL濃縮至干，殘渣用50 μL乙腈-水(體積比80∶20)復溶，離心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液進樣分析，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比計算甘草次酸和內(nèi)標的基質(zhì)效應.

1.4統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SPSS 17.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進行各指標組間差異的顯著性檢驗，以P< 0.05作為檢驗的顯著性差異.

2結(jié)果與討論

2.1LC-MS/MS條件優(yōu)化

近年來，采用LC-MS測定甘草次酸含量的研究報道多采用一級質(zhì)譜掃描方式進行測定[4]，這種掃描方式無法減小因生物基質(zhì)效應給測定結(jié)果造成的干擾. 本研究采用電噴霧離子源，負離子掃描模式，掃描方式為多反應檢測對腎臟中甘草次酸的含量進行測定. 在保證提高檢測靈敏度、準確度的同時，可有效的減小生物基質(zhì)效應給測定結(jié)果造成的干擾. 本研究對二級質(zhì)譜掃描進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸為153.1→109.1. 毛細管電壓3 500 V，離子源溫度330 ℃，甘草次酸和原兒茶酸的毛細管出口電壓分別為200 V和100 V，碰撞電壓(CE)分別為38 V和15 V；保護氣流量10 L/min. 并對色譜條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，流動相為乙腈-水(體積比80∶20)，流速為1 mL/min，進樣量10 μL.

2.2內(nèi)標物的選擇及方法的專屬性

采用內(nèi)標法測定甘草次酸含量時，有研究報道熊果酸、格列喹酮、潑尼松龍作為內(nèi)標物質(zhì)[4-6]. 根據(jù)內(nèi)標物質(zhì)的選擇原則，本實驗選擇原兒茶酸、齊墩果酸、沒食子酸為內(nèi)標物進行比較，原兒茶酸的化學結(jié)構(gòu)與甘草次酸類似，能完全溶解于待測組織勻漿液中，不與甘草次酸發(fā)生化學作用，并與甘草次酸色譜峰完全分離，甘草次酸和原兒茶酸的保留時間分別為3.265和0.897 min(見圖1)，且甘草次酸m/z為469.4→425.4，原兒茶酸為153.1→109.1. 所選3種內(nèi)標物中原兒茶酸響應最高，穩(wěn)定性最好，所以選用原兒茶酸作為內(nèi)標物. 目前，有關(guān)選用原兒茶酸作為甘草次酸含量測定的研究未見報道.

在分析復雜的生物組織樣品時，生物基質(zhì)效應對測量結(jié)果的影響不容忽視. 由圖1可見，小鼠腎臟組織中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾甘草次酸和原兒茶酸的測定. 結(jié)果表明，該方法具有良好的專屬性.

2.3標準曲線、精密度、準確度、回收率、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應

在優(yōu)化的實驗條件下，利用建立的LC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)進行分析. 甘草次酸回歸方程為Y=0.123 03X+1.036 7(r=0.998 9)，結(jié)果表明，在9.600～960.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

精密度、準確度、回收率、穩(wěn)定性與基質(zhì)效應見表1. 實驗證明，日內(nèi)及日間精密度、準確度和回收率較好，并且基質(zhì)效應不會對甘草次酸的含量測定結(jié)果造成影響.

此外，對樣品的穩(wěn)定性進行了考察，結(jié)果在室溫條件下穩(wěn)定24 h，-20 ℃冰凍條件下穩(wěn)定30 d，反復凍融3次均不影響樣品中甘草次酸的含量.

表1　甘草次酸的精密度、準確度、回收率及基質(zhì)效應考察結(jié)果

2.4應用及討論

結(jié)果表明，甘草次酸對照組、甘草次酸聯(lián)合用藥低劑量組、甘草次酸聯(lián)合用藥高劑量組中甘草次酸的含量分別為(4 992.6±719.7) ng/g、(337.18±119.16) ng/g和(862.70±251.96) ng/g，對照組和雄黃組未檢出甘草次酸. 甘草次酸高劑量組、甘草次酸對照組與甘草次酸低劑量組比較有統(tǒng)計學意義(P< 0.05).

雄黃是含砷礦物藥，雄黃及其制劑中含有大量砷[7-8]，在給予雄黃的大鼠血、腦及腎臟中均檢測到砷[9-11]，而長期服用含雄黃制劑易引起藥源性慢性砷中毒，造成腎臟損害[12-15]. 臨床上，雄黃常與甘草配伍使用. 甘草為國老藥，具有調(diào)和諸要的作用，對雄黃的毒性也有一定的解毒作用[16]. 本研究結(jié)果表明，甘草次酸干預后，腎臟中甘草次酸含量明顯降低，可能與甘草次酸對雄黃的解毒作用有關(guān)，具體機制有待于進一步探討.

3結(jié)論

以原兒茶酸為內(nèi)標物質(zhì)，采用二級質(zhì)譜掃描的方法建立了LC-MS/MS測定腎臟中甘草次酸含量的方法，該法具有較高的專屬性、靈敏度、精密度、準確度和回收率，可用于甘草與雄黃配伍機制的研究.

參考文獻：

[1] TAIRA Z, YABE K, HANMAGUCHI Y, et al. Effects of Sho-saiko-to extract and its components, baicalin, baicalein, glycyrrhizin and glycyrrhetic acid,on pharmacokinetic behavior of salicylamide in carbon tetrachloride intoxicated rats [J]. Food Chem Toxicol, 2004, 42(5)：803-807.

[2] JEONG H G, YOU H J, PARK S J, et al. Hepatoprotective effects of 18 beta-glycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced liver injury: inhibition of cytochrome P450 2E1 expression [J]. Pharmacol Res, 2002, 46(3): 221-227.

[3] 張明發(fā), 金玉潔, 沈雅琴. 甘草酸保護腦損傷及改善記憶功能的藥理作用研究進展[J]. 藥物評價研究, 2013, 1(36): 59-63.

[4] 王興蕊, 歐陽慧子, 竇婷, 等. LC-MS法測定大鼠血漿中甘草次酸及其藥動學研究[J]. 天津中醫(yī)藥大學學報, 2014, 34(4): 229-232.

[5] 荊晶, 陳西敬, 任偉超, 等. LC-MS法測定人血漿中的甘草次酸[J]. 藥物分析雜志, 2007, 27(5): 673-676.

[6] 張軍, 陳玟, 居文政, 等. LC-MS/MS法測定人血漿中甘草次酸及其臨床藥代動力學研究[J]. 中國藥理學通報, 2011, 27(9): 1313-1316.

[7] 姜泓, 張穎花, 丁敬華, 等. HPLC-HG-AFS法測定雄黃中As(Ⅲ)的含量[J]. 化學研究, 2008, 19(4): 67-69.

[8] 張穎花, 霍韜光, 姜泓, 等. 高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法檢測牛黃解毒片中的砷[J]. 化學研究, 2012, 23(4): 60-63.

[9] 霍韜光, 暢蓓, 李維凱, 等. 雄黃染毒后大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化[J]. 化學研究, 2012, 23(2): 87-90.

[10] 霍韜光, 楊卉蕾, 暢蓓, 等. 雄黃對大鼠腦組織能量代謝的影響[J]. 化學研究, 2012, 23(1): 53-55.

[11] 張穎花, 高詠, 霍韜光, 等. 利用氫化物發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)測定雄黃染毒大鼠血中砷的含量[J]. 化學研究, 2013, 24(3): 274-276.

[12] 苑潔, 霍韜光, 王艷蕾, 等. HG-FAAS法測定雄黃染毒小鼠肝及腎臟中的砷含量[J]. 化學研究, 2015, 26(1): 61-63.

[13] 陳默, 苑潔, 霍韜光, 等. HPLC測定雄黃染毒小鼠血漿及肝臟中活性硫的含量[J]. 化學研究, 2016, 27(1): 81-84.

[14] 梁愛華, 李春英, 王金華, 等. 雄黃的毒性研究[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(14): 1889-1894.

[15] 李國明, 劉新清, 張雪艷, 等. 雄黃對小鼠腎臟形態(tài)學的影響[J]. 河北醫(yī)藥, 2002, 24(1): 60-60.

[16] 董菊, 嚴曉鷹, 王明燕, 等. 牛黃解毒片配伍影響雄黃砷毒性的動物實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2014, 2(25): 317-319.

[責任編輯：吳文鵬]

收稿日期：2016-01-11.

基金項目：國家自然科學基金項目(81473417).

作者簡介：封聰(1989-), 男, 碩士生, 研究方向為分析毒理學. *通訊聯(lián)系人, E-mail: jianghong@mail.cmu.edu.cn.

中圖分類號：R286.02

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0318-05

Glycyrrhetinic acid content in kidney of mouse determined by LC-MS/MS

FENG Cong1, HUO Taoguang1, WANG Shouyun2, ZHANG Yinghua1,WU Hui1, JIANG Hong1*

(1.CollegeofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Abstract:LC-MS/MS method was established for the determination of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse. Multiple reaction monitoring scanning mode was used for the quantification of glycyrrhetinic acid using protocatechuic acid as the internal standard. The method has the advantages of sensitive, accurate, rapid and a wide linear range. The method was successfully used for the quantification of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse treated combination with glycyrrhetinic acid and realgar.

Keywords:LC-MS/MS; glycyrrhetinic acid; protocatechuic acid; content determination