盧根林，　吳愛兵，　王宏賓

(1義烏市中心醫(yī)院普通外一科， 浙江 義烏 322000； 2廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 523808； 3青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科, 青海 西寧 810001)

硫化氫對腸缺血再灌注損傷大鼠回腸上皮細胞凋亡的影響*

盧根林1△，吳愛兵2，王宏賓3

(1義烏市中心醫(yī)院普通外一科， 浙江 義烏 322000；2廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 523808；3青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科, 青海 西寧 810001)

[摘要]目的： 探討硫化氫(H2S)對大鼠缺血再灌注(I/R)損傷回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能及凋亡的影響。方法：24只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(sham)組、I/R組和I/R+NaHS組。建立大鼠腸I/R損傷模型。在灌注前10 min時經I/R+NaHS組大鼠尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1輸注直到再灌注2 h，實驗結束后取回腸標本測定回腸上皮細胞形態(tài)和呼吸功能指標。敏感硫電極法測定血漿H2S含量。RT-PCR檢測回腸組織Bcl-2和Bax mRNA表達，Western blot 檢測總caspase-3、活化型caspase-3、細胞色素C(Cyt C)、Bcl-2和Bax蛋白表達。結果: I/R組線粒體的面積、體積密度、最大直徑、最小直徑、等效直徑以及活化型caspase-3、Cyt C和Bax表達均顯著大于I/R+NaHS和sham組(P<0.01)。I/R組線粒體數(shù)量、周長、比表面、面積密度和粒子數(shù)密度、血漿H2S、R3、R4、RCR、P/O和Bcl-2表達均顯著小于I/R+NaHS和sham組(P<0.01)。結論:硫化氫下調活化型caspase-3、Cyt C和Bax的蛋白水平，上調Bcl-2表達，對I/R損傷大鼠回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能均有保護作用。

[關鍵詞]缺血再灌注損傷； 硫化氫； 線粒體

線粒體是細胞呼吸和產能的主要場所。缺血、缺氧時線粒體首先受損,進而損害整個細胞的功能[1]。線粒體-細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)途徑是介導細胞凋亡的內源性途徑[2-3]。H2S由小腸組織胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)催化L-半胱氨酸生成，抑制小腸上皮細胞凋亡，對腸缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷大鼠小腸黏膜屏障和肝功能起保護作用[4-5]，但其作用機制尚未闡明。H2S是否對線粒體及內源性凋亡途徑有保護作用，本課題加以研究，結果報告如下。

材料和方法

1動物、試劑、儀器

健康雄性Wistar大鼠，SPF級，6周齡，體質量200～250 g，由浙江大學醫(yī)學院動物中心提供，動物合格證號為201001018。

NaHS購自Sigma；羊抗大鼠caspase-3、活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax多克隆抗體購自Santa Cruz；羊抗大鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG、DAB顯示劑、SDS-PAGE凝膠、轉膜液、硝酸纖維膜和Bradford蛋白試劑盒均購自北京中山生物技術有限公司；Bcl-2的上游引物序列為 5’-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3’，下游引物序列為 5’-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’，擴增片段為411 bp；Bax的上游引物序列為5’-ATTGGAGATGAACTGGACAAT-3’，下游引物序列為5’-CCACA AAGATGGTCACTGTC-3’，擴增片段為337 bp；β-actin的上游引物序列為5’-CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG-3’，下游引物序列為5’-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3’，擴增片段為378 bp。各基因引物由Invitrogen合成；TRIzol和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa。

電泳儀(Bio-Rad)，3066型水平臺式記錄儀敏感硫電極和PXS-270離子計購于上海雷磁儀器廠，圖像分析軟件(VILBER LOURMAT)。

2方法

2.1實驗動物分組及腸缺血-再灌注損傷模型的建立按隨機數(shù)字表法將24只雄性Wistar大鼠分為假手術(sham)組、I/R組和I/R+NaHS組，每組8只。腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉，經腹正中切口剖腹及游離腸系膜上動脈，鉗夾I/R、I/R+NaHS組大鼠腸系膜上動脈60 min和再灌注120 min，建立大鼠腸缺血-再灌注損傷模型[4-5]。灌注前10 min經I/R+NaHS組大鼠尾靜脈注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1輸注直到再灌注2 h，向S、I/R組尾靜脈注入相同體積的生理鹽水，作用時間和持續(xù)時間均同I/R+NaHS組[4-5]。實驗結束后處死大鼠，取回腸末端標本用于電子顯微鏡檢測、線粒體制備。取血離心分離血漿，-20 ℃保存。

2.2血漿H2S濃度測定參照文獻[6-7]采用敏感硫電極法完成H2S濃度測定。

2.3線粒體形態(tài)和功能檢測參照文獻[1-3]制備小腸上皮細胞線粒體。(1)在電子顯微鏡測量線粒體并進行圖像分析:測量線粒體的面積、周長、最大直徑和最小直徑，并計算線粒體的體積密度、面積密度、等效直徑、比表面和粒子數(shù)密度，均以像素(pi-xel，P)作為單位。(2)Clark電極法測線粒體呼吸功能:以10 mmol/L琥珀酸鈉為底物，反應介質的配置參照文獻[1]，pH 7.5，加人1.2 mg線粒體蛋白，反應體積1.6 mL，測定溫度30 ℃，反應1 min后，加入400 nmol/L ADP，在3066型水平臺式記錄儀上記錄線粒體的氧化還原反應曲線，測定呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)和P/O值，計算Ⅲ和IV呼吸耗氧速率(R3和R4)，即單位時間內單位線粒體蛋白的耗氧摩爾數(shù)(μmol·g-1·min-1)。

2.4RT-PCR檢測回腸組織Bcl-2和Bax mRNA表達TRIzol一步法提取回腸黏膜總RNA，電泳見28S和18S條帶，以2.5 μg總RNA為模板按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。再按PCR試劑盒說明書進行cDNA擴增。PCR條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃(β-actin和Bax)/58 ℃(Bcl-2)30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 7 min。各取7 μL PCR產物和3.5 μL DNA marker上樣，各目的基因擴增產物和內參照β-actin擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析軟件進行目的基因電泳條帶密度分析，以Bcl-2/β-actin和Bax/β-actin分別表示Bcl-2和Bax的mRNA表達。

2.5Western blot 檢測活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax蛋白的表達取回腸組織冰凍標本0.5 g于RIPA裂解液中碾磨，以Bardford法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白行SDS聚丙酰胺凝膠，轉膜(0.65 mA/ cm2)；預雜交室溫3 h，加入I抗[按1∶1 000(caspase-3)、1∶500(cleaved caspase-3)、1∶1 500(Bcl-2、Bax)、1∶750(Cyt C)和1∶600(β-actin)比例稀釋]，4 ℃過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG II抗室溫反應1.5 h，0.1% TBST洗膜，ECL發(fā)光壓片顯影。使用BandScan分析膠片灰度值，以cleaved caspase-3/總caspase-3以及Cyt C、Bcl-2、Bax/β-actin灰度比值表示相對表達量。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1回腸上皮細胞超微結構改變

Sham組回腸黏膜微絨毛無脫失，線粒體豐富，無腫脹。I/R組回腸黏膜微絨毛脫失，線粒體腫脹、空泡變性。I/R+NaHS組少許回腸黏膜微絨毛脫失，部分線粒體腫脹、空泡變性，見圖1。

Figure 1.The ultrastructural changes of the ileum epithelial cells under electron microscope.

圖1電鏡下回腸上皮細胞超微結構變化

2血漿硫化氫濃度的變化

I/R組血漿H2S濃度顯著小于I/R+NaHS和sham組(P<0.01),見表1。

3回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能變化

I/R組線粒體的面積、體積密度、最大直徑、最小直徑和等效直徑均顯著大于I/R+NaHS和sham組(P<0.01)。I/R組線粒體數(shù)量、周長、比表面、面積密度和粒子數(shù)密度、R3、R4、RCR、P/O值均顯著小于I/R+NaHS和sham組(P<0.01),見表1、2。

表1各組大鼠H2S以及回腸上皮細胞線粒體數(shù)量、面積、周長和直徑的比較

Table 1.Comparison of plasma H2S and area, circumference, count and diameter of ileum epithelial cell mitochondria in rats (Mean±SD.n=8)

GroupH2S(μmol/L)CMArea(×103)C(×103)ΦmaxΦminΦeSham42.7±7.224.3±4.61.8±0.45.7±0.564.5±7.432.7±6.250.7±8.9I/R24.8±2.7**12.7±3.3**5.3±0.9**1.8±0.3**87.2±9.6**61.2±7.9**78.2±5.1**I/R+NaHS35.3±3.2**##18.2±5.2**##3.6±0.5**##3.2±0.7**##78.3±10.2**##45.4±5.5**##67.4±6.3**##

CM: count of mitochondria; C: circumference; Φmax: maximum diameter; Φmin: minimum diameter; Φe: equivalent diameter.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

表2各組大鼠回腸上皮細胞線粒體密度、比表面和呼吸功能的比較

Table 2.Comparison of density, specific surface area and respiratory function of ileum epithelial cell mitochondria in rats (Mean±SD.n=8)

GroupVD(×10-1)AD(×10-2)PD(×10-5)SSA(×10-2)RCRP/OR3(μmol·g-1·min-1)R4(μmol·g-1·min-1)Sham1.0±0.12.2±0.410.4±1.610.2±1.23.5±0.62.2±0.4157.1±20.482.7±7.1I/R2.4±0.5**0.9±0.1**3.7±0.9**6.2±0.8**2.5±0.4**1.2±0.2**102.5±17.3**47.9±6.4**I/R+NaHS1.7±0.4**##1.4±0.5**##6.9±0.8**##8.8±0.6**##3.2±0.3##2.1±0.5##124.5±19.2**##64.2±5.7**##

VD: volume density; AD: area density; PD: population density; SSA: specific surface area; RCR: respiratory control ratio.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

4回腸組織Bcl-2和Bax mRNA水平以及活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax的蛋白水平

I/R組Bax mRNA水平及總caspase-3、活化型caspase-3、Cyt C、Bax的蛋白水平高于I/R+NaHS和sham組，Bcl-2 mRNA和蛋白表達低于I/R+NaHS和sham組(P<0.01),見圖2、3及表3。

Figure 2.Hydrogen sulfide up-regulated Bcl-2 mRNA and down-regulated Bax mRNA in ileum epithelial cells of rats. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

圖2硫化氫下調大鼠回腸上皮細胞Bax mRNA并上調Bcl-2 mRNA的表達

Figure 3.Hydrogen sulfide up-regulated Bcl-2 protein and down-regulated cleaved caspase-3, Cyt C and Bax proteins in ileum epithelial cells of rats.

圖3硫化氫下調大鼠回腸上皮細胞活化型caspase-3、Cyt C和Bax蛋白并上調Bcl-2蛋白的表達

討論

線粒體為細胞能量代謝的重要細胞器，三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化的部位分別位于基質內、內膜，兩者緊密相連。線粒體的這種結構與其呼吸功能及能量合成功能密切相關。線粒體形態(tài)和功能的損傷是導致細胞發(fā)生凋亡或壞死及其它后繼變化的主要原因[1-3]。線粒體體積大小用等效直徑、面積以及體積密度表示，線粒體數(shù)量大小用粒子數(shù)和粒子密度表示，線粒體形態(tài)和功能用單位線粒體所具有的膜表面(比表面)、周長和面密度表示[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)I/R組回腸黏膜微絨毛脫失，線粒體腫脹、空泡變性。I/R組線粒體體積增大(面積、體積密度和等效直徑大于sham組)，線粒體數(shù)量減少(線粒體數(shù)和粒子數(shù)密度小于sham組),周長、面積密度、比表面、RCR、P/O、R3和R4減小，提示缺血再灌注損傷大鼠回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能異常。細胞凋亡途徑分外源性(死亡受體)、內源性(線粒體)和內質網凋亡3個途徑。Bcl-2家族中抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因bax，分別編碼位于線粒體膜表面的Bcl-2和Bax蛋白，形成異源、同源性二聚體，是線粒體完整性的關鍵調節(jié)者。Bax表達上調時線粒體膜通透性改變，細胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子從線粒體釋放到細胞質，凋亡小體形成，細胞凋亡；Bcl-2占優(yōu)勢時細胞存活[8-10]。Caspase是一組以天冬氨酸為底物的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用。Caspase-3為關鍵的凋亡執(zhí)行分子，在凋亡信號轉導的許多途徑中發(fā)揮功能，其表達水平的高低決定著細胞凋亡程度[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與sham組比較，I/R組Bcl-2表達下調，Bax、Cyt C和活化型 caspase-3表達上調。因此線粒體-Cyt C途徑(即內源性凋亡途徑)的Bax、Cyt C、活化型caspase-3表達上調和Bcl-2表達下調是導致缺血再灌注大鼠回腸上皮細胞線粒體細胞形態(tài)和功能異常的機制之一。H2S由小腸組織CSE催化L-半胱氨酸生成，抑制小腸上皮細胞凋亡，對腸缺血再灌注損傷大鼠小腸黏膜屏障和肝功能起保護作用[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)電鏡下I/R+NaHS組少許回腸黏膜微絨毛脫失，部分線粒體腫脹、空泡變性；I/R+NaHS組回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能顯著優(yōu)于I/R組。因此H2S對缺血再灌注損傷大鼠回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能起保護作用。

表3　各組大鼠回腸組織活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax表達的比較

**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

H2S下調活化型caspase-3和PARP的蛋白水平，減少小腸上皮細胞凋亡[4]。H2S通過抑制 STAT3信號轉導通路，減少肝細胞凋亡[5]。本研究發(fā)現(xiàn)I/R+NaHS組Bcl-2表達量高于I/R組,Bax、Cyt C和活化型caspase-3表達量低于I/R組;H2S與活化型caspase-3、Cyt C和Bax呈負相關，與Bcl-2呈正相關。因此H2S通過上調Bcl-2表達，下調Bax、Cyt C和caspase-3表達，即抑制線粒體-Cyt C途徑(內源性凋亡途徑)，保護回腸上皮細胞線粒體形態(tài)和功能，減輕大鼠回腸缺血再灌注損傷。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Influence of hydrogen sulfide on ileal epithelial cell apoptosis in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Gen-lin1, WU Ai-bing2, WANG Hong-bin3

(1TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,YiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2OncologyCenter,TheHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang523808,China;3DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,TheHospitalAffiliatedtoQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:lugenlin007@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the influence of hydrogen sulfide (H2S) on intestinal epithelial cell mitochondrial morphology and function and the expression of caspase-3, cleaved caspase-3, cytochrome C (Cyt C), Bcl-2 and Bax in rats with intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury. METHODS: Wistar rats (n=24) were randomly divided into 3 groups (8 in each group): sham group, I/R group and I/R+sodium hydrosulfide (NaHS) group. The animal model of intestinal I/R injury was established. The rats in I/R+NaHS group received NaHS (100 μmol/kg bolus +1 mg·kg-1·h-1infusion) 10 min prior to the onset of reperfusion, whereas the rats in I/R group and sham group received equal volume of normal sodium. Ileum epithelial mitochondrial morphology and function were measured. Plasma H2S was detected by sensitive sulfide electrode. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA was studied by RT-PCR. The protein levels of caspase-3, cleaved caspase-3, cytochrome C (Cyt C), Bcl-2 and Bax were tested by Western blot.RESULTS: The area, volume density, maximum diameter, minimum diameter and equivalent diameter of mitochondria, and the expression of cleaved caspase-3， Cyt C and Bax in I/R group were significantly higher than those in I/R+NaHS and sham groups (P<0.01). The mitochondrial count, circumference, specific surface area, area density and population density, plasma H2S， respiratory control rate (RCR), the ratio of P/O, R3, R4, and the expression of Bcl-2 in I/R group were sharply lower than those in I/R+NaHS and sham groups (P<0.01). H2S was negatively correlated with caspase-3, cleaved caspase-3, Cyt C and Bax (P<0.01), and was positively correlated with Bcl-2 (P<0.01). CONCLUSION: H2S has a protective effect on mitochondrial morphology and function in rats with intestinal I/R injury by down-regulating cleaved caspase-3, Cyt C and Bax and up-regulating Bcl-2.

[KEY WORDS]Ischemia-reperfusion injury; Hydrogen sulfide; Mitochondria

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0124- 05

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 10- 29

*[基金項目]國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No.81201672)；義烏市人才引進項目立項項目(No.2012-R-04)

通訊作者△Tel: 0570-7368680; E-mail: lugenlin007@163.com

[中圖分類號]R656.7; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.021