黃棟棟，　孟易禹，　孫棟勛，　金巧智，　陳武兵，　蔡志毅, △

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000； 2臺(tái)州市市立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 臺(tái)州 318000)

牛蒡子苷元誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制*

黃棟棟1，孟易禹1，孫棟勛1，金巧智2，陳武兵2，蔡志毅1, 2△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000；2臺(tái)州市市立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 臺(tái)州 318000)

[摘要]目的： 探討牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)對(duì)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡的影響及其分子作用機(jī)制。方法: 經(jīng)不同濃度的ARG處理CNE-1細(xì)胞后，采用CCK-8法檢測(cè)ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞活力的影響；caspase-3及caspase-9活性檢測(cè)法檢測(cè)CNE-1細(xì)胞caspase-3及caspase-9活性的變化；流式細(xì)胞術(shù)分析CNE-1細(xì)胞凋亡率的變化； real-time PCR法檢測(cè)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的變化；Western blot法檢測(cè)PI3K/AKT/XIAP通路蛋白水平的變化。結(jié)果: 隨濃度和時(shí)間的增加，ARG可抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的活力(P<0.01)；caspase-3及caspase-9活性的增加及細(xì)胞凋亡率的升高表明ARG可顯著促進(jìn)CNE-1細(xì)胞的凋亡；與對(duì)照組相比，PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路相關(guān)分子對(duì)mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)；ARG可明顯下調(diào)PI3K/AKT/XIAP各蛋白水平(P<0.05)。結(jié)論: ARG可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，降低PI3K/AKT/XIAP相關(guān)分子水平可能是其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]牛蒡子苷元； 細(xì)胞凋亡； 鼻咽癌

牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥牛蒡子中提取出的木脂素類化合物[1]，是牛蒡子重要的藥理活性成分。近年來(lái)研究顯示，ARG具有顯著的抗炎[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]等作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，ARG可以抑制大腸癌SW480細(xì)胞的增殖[5]和介導(dǎo)人白血病細(xì)胞的凋亡[6]，并且能夠顯著增強(qiáng)肺癌H460細(xì)胞對(duì)順鉑等抗腫瘤藥物的化學(xué)敏感性[7]。但是關(guān)于ARG對(duì)鼻咽癌的抗腫瘤效果仍未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，并且其具體的抗腫瘤分子機(jī)制也尚未闡明。本研究以鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株為研究模型，檢測(cè)ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，并且對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料和方法

1材料

ARG購(gòu)自Sigma；鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1為高分化人鼻咽癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購(gòu)自Gibco；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo；caspase-3及caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；TRIzol reagent、cDNA第一鏈合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Tiangen；兔抗人GAPDH、PI3K、AKT、p-AKT和XIAP單克隆 I 抗購(gòu)自CST；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore；DMSO、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購(gòu)自北京索萊寶公司。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，平均2 d換液1次，按1∶3傳代，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2藥物配制ARG溶于一定量DMSO，配制成濃度為1×105μmol/L的母液，避光，-20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋母液至所需藥物濃度(10 μmol/L、20 μmol/L 、40 μmol/L和80 μmol/L ，DMSO終濃度均低于0.1%)。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化將CNE-1細(xì)胞按每孔3×103接種于96孔板中，并將96孔板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分3組：空白組(不含細(xì)胞)、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M和對(duì)照組各加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL；實(shí)驗(yàn)組每孔各加入含不同濃度的ARG的培養(yǎng)液(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)100 μL。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后各孔分別加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1～2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度A值，觀察細(xì)胞增殖抑制情況。各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活力抑制率(%)=(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將CNE-1細(xì)胞按每孔5×105接種于6孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后換液。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組加未做處理的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度的ARG培養(yǎng)液(10 μmol/L和20 μmol/L)，培養(yǎng)24 h。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，離心去上清，加入200 μL 1×binding buffer懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min，再加入5 μL PI，混勻，室溫避光5 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。

2.5Caspase-3及caspase-9活性的檢測(cè)將CNE-1細(xì)胞按每孔4×105接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)及處理同流式實(shí)驗(yàn)所述。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌1次， 4 ℃、600×g離心5 min，棄上清，加入適量裂解液(每2×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL裂解液)，混勻，冰浴裂解15 min。4 ℃、20 000×g離心15 min后轉(zhuǎn)移上清至預(yù)冷的1.5 mL離心管中，按照caspase-3及caspase-9活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書順序加入檢測(cè)試劑進(jìn)行活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。37 ℃孵育2 h后酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)樣本在405 nm的A值，觀察caspase-3及caspase-9活性變化情況。

2.6Real-time PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)將CNE-1細(xì)胞以每孔4×105接種于6孔板，加藥孵育24 h后收集細(xì)胞加1 mL TRIzol提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)RNA純度。按cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，按SYBR Green熒光染料試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH的上游引物序列為5’-CAT CAG CAA TGC CTC CTG CAC-3’，下游引物序列為為5’-TGA GTC CTT CCA CGA TAC CAA AGT T-3’；PI3K的上游引物序列為5’-CTG TGT GGG ACT TAT TGA GGT GGT-3’，下游引物序列為5’-ACT GAT GTA GTG TGT GGC TGT TGA-3’；AKT的上游引物序列為5’-TGT GAA GGA GGG TTG GCT GC-3’，下游引物序列為5’-ACT GCG CCA CAG AGA AGT TGT T-3’；XIAP的上游引物序列為5’-TGT TTC AGC ATC AAC ACT GGC ACG-3’，下游引物序列為5’-GCA TGA CAA CTA AAG CAC CGG AC-3’。各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。記錄各孔Ct值，并采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.7Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)將CNE-1細(xì)胞以每孔2×105接種于6孔板，加藥孵育48 h后每孔用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并離心，棄上清，加入適量細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min后，4 ℃、15 000×g離心15 min，取上清液，Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。各個(gè)樣本蛋白加入1×SDS上樣緩沖液100 ℃變性10 min后，等量上樣，采用SDS-PAGE法將蛋白通過(guò)電泳及轉(zhuǎn)膜后移至PVDF膜。然后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，加 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入TBST搖床充分洗膜，加 II 抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜后加ECL發(fā)光液顯影曝光。 I 抗稀釋比例均為1∶1 000，II 抗稀釋比例為1∶10 000。每個(gè)樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，分析灰度值，計(jì)算各組與內(nèi)參照GAPDH灰度的相對(duì)比值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間采用SNK-q檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)ARG處理CNE-1細(xì)胞后，ARG(10 μmol/L)即可抑制細(xì)胞活力，ARG(80 μmol/L)的細(xì)胞抑制率顯著增加；且各濃度ARG處理CNE-1細(xì)胞的抑制率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，經(jīng)ARG處理24 h的IC50為23.51 μmol/L，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Arctigenin inhibited the viability of the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs10 μmol/L.

圖1牛蒡子苷元對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活性的抑制

2ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡率的影響

如圖2所示， CNE-1細(xì)胞經(jīng)0、10和20 μmol/L濃度的ARG處理后，凋亡率分別為1.46%、15.4%和25.7%，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 2.The apoptosis of the CNE-1 cells after treated with ARG. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2經(jīng)不同濃度牛蒡子苷元處理后CNE-1細(xì)胞的凋亡率

3ARG對(duì)CNE-1細(xì)胞caspase-3及caspase-9活性的影響

應(yīng)用caspase-3及caspase-9活性試劑盒檢測(cè)經(jīng)ARG處理的CNE-1細(xì)胞，將對(duì)照組活性值設(shè)為1，經(jīng)10 μmol/L和20 μmol/L ARG處理24 h后caspase-3活性分別為1.59±0.08和5.31±0.34,caspase-9活性分別為1.34±0.11和3.55±0.27，提示ARG可上調(diào)caspase-3及caspase-9的活性，且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of ARG on the activity of caspase-3 and -9 in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖3牛蒡子苷元對(duì)CNE-1細(xì)胞caspase-3及caspase-9活性的影響

4ARG對(duì)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，以對(duì)照組結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算得出10 μmol/L ARG組PI3K、AKT及XIAP 對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.02、0.90±0.03和0.79±0.03；20 μmol/L ARG組分別為0.60±0.02、0.72±0.01和0.55±0.04。說(shuō)明ARG可下調(diào)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effects of ARG on the mRNA expression of PI3K/AKT/XIAP pathway-related molecules in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖4牛蒡子苷元對(duì)CNE-1細(xì)胞PI3K/AKT/XIAP 通路分子mRNA表達(dá)的影響

5ARG對(duì)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算各個(gè)蛋白與GAPDH灰度的相對(duì)比值，設(shè)置對(duì)照組各成員蛋白表達(dá)量為1，10 μmol/L ARG組PI3K、AKT、p-AKT和XIAP蛋白水平分別為0.85±0.04、0.81±0.01、0.45±0.02及0.78±0.03；20 μmol/L ARG組各成員的蛋白水平分別為0.38±0.02、0.66±0.01、0.19±0.02及0.23±0.02。如圖5所示，10 μmol/L和20 μmol/L ARG處理CNE-1細(xì)胞后PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組均出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討論

鼻咽癌是我國(guó)廣東、廣西、福建和浙江等南方地區(qū)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，發(fā)病率占當(dāng)?shù)仡^頸外科腫瘤的首位。目前鼻咽癌的治療多采取以放療及化療為主的綜合療法，但放射抗拒和化療耐藥及其副作用是治療失敗的重要原因[8]。而傳統(tǒng)中藥具有可以增加化療療效，降低放療化療毒副作用，延長(zhǎng)生存時(shí)間，提高生活質(zhì)量和增加免疫力的效果。因此許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者試圖尋找天然藥物或其活性成分用于鼻咽癌治療，已有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素衍生物T83可促進(jìn)同源不同輻射抗性鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，并且有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)漢防己甲素可對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株的放射起增敏作用[9-10]。

牛蒡子是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其味苦、性寒，具有消炎、降糖、消腫等功效[11]。牛蒡子苷元是牛蒡子重要的木脂素提取物，現(xiàn)代藥理學(xué)表明其具有一定的抗腫瘤作用。其發(fā)揮作用主要是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成及介導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[12-14]。但是關(guān)于ARG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的基礎(chǔ)研究報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARG可顯著抑制鼻咽癌CNE-1的細(xì)胞活力，并且ARG對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加而提升，表明ARG對(duì)CEN-1細(xì)胞的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。進(jìn)一步通過(guò)caspase-3和caspase-9活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ARG可上調(diào)caspase-3及caspase-9的活性，說(shuō)明ARG可能是通過(guò)上調(diào)caspase-3及caspase-9的活性從而參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Figure 5.The effects of ARG on the protein levels of PI3K/AKT/XIAP pathway-related molecules in the CNE-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5牛蒡子苷元對(duì)CNE-1細(xì)胞PI3K/AKT/XIAP 通路分子蛋白水平的影響

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)性死亡的過(guò)程，涉及多種凋亡相關(guān)因子的相互作用。Caspase-3及caspase-9屬于細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑中caspase家族的重要成員，caspase-9活化后激活caspase-3，caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，直接參與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[15]。而XIAP是屬于凋亡抑制蛋白家族的主要成員，是IAP家族中最強(qiáng)的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制主要可能是通過(guò)與caspase-3及caspase-9結(jié)合后保留caspase-3與caspase-9作用區(qū)域之間的突變位點(diǎn)，提高了caspase-3與caspase-9的位點(diǎn)突變率，當(dāng)發(fā)生結(jié)合位點(diǎn)突變時(shí)則可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[16]。Real-time PCR結(jié)果表明經(jīng)ARG處理CNE-1細(xì)胞后，PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路mRNA表達(dá)降低。進(jìn)一步在蛋白水平運(yùn)用Western blot法檢測(cè)得出，經(jīng)ARG作用后 PI3K/AKT/XIAP蛋白表達(dá)下調(diào)。這表明ARG可能是通過(guò)下調(diào)XIAP的表達(dá)，激活caspaes-3和caspase-9，從而可降低XIAP對(duì)caspaes-3和caspase-9的拮抗作用，因此促進(jìn)二者的活化，直接參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證實(shí)ARG可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/AKT/XIAP信號(hào)通路有關(guān)。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARG誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡作用，仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討ARG的抗腫瘤作用。本研究可為ARG用于鼻咽癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為ARG應(yīng)用于臨床奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of arctigenin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1

HUANG Dong-dong1, MENG Yi-yu1, SUN Dong-xun1, JIN Qiao-zhi2, CHEN Wu-bing2, CAI Zhi-yi1, 2

(1TheFirstClinicalMedicalInstitute,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;2DepartmentofOtolaryngology,TaizhouMunicipalHospital,Taizhou318000,China.E-mail:caizy008@tom.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of arctigenin on the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 and its potential mechanism. METHODS: The inhibition of cell viability was analyzed by CCK-8 assay. The activity of caspase-3 and caspase-9 was analyzed by caspase-3 and caspase-9 activity kit. Apoptotic cell percentage was evaluated by Annexin V-PI staining. The expression of PI3K/AKT/XIAP signal pathway-related molecules at mRNA and protein levels was analyzed by real-time PCR and Western blot. RESULTS: Arctigenin inhibited the cell activity in a dose- and time-dependent manner after treatment with arctigenin at concentrations of 10, 20, 40 and 80 μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h (P<0.01). Arctigenin also increased the activity of caspase-3 and caspase-9 and the apoptotic rate (P<0.05), and down-regulated the mRNA and protein expression of PI3K/AKT/XIAP signal pathway-related molecules (P<0.05).CONCLUSION: Arctigenin induces the apoptosis of CNE-1 cells through PI3K/AKT/XIAP signal pathway.

[KEY WORDS]Arctigenin; Apoptosis; Nasopharyngeal carcinoma

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0101- 05

[收稿日期]2015- 06- 17[修回日期] 2015- 09- 28

*[基金項(xiàng)目]浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目(No. 2015ZB132)

通訊作者△Tel： 0576-88858023； E-mail： caizy008@tom.com

[中圖分類號(hào)]R965; R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.017