方　芳，　趙良中，　李　強(qiáng)，　陳　爽，　姜曉明，　張　鐸，　王立國

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 1免疫學(xué)教研室， 2附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013)

胡桃醌對卵巢癌SKOV3細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響*

方芳1，趙良中1，李強(qiáng)1，陳爽1，姜曉明1，張鐸1，王立國2△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院1免疫學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013)

[摘要]目的： 探討胡桃醌對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制。方法: 采用MTT法檢測胡桃醌對卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長的作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測胡桃醌對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響；采用DCF-DA染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(ROS)水平；采用Western blot檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞細(xì)胞色素C(Cyt C)和活化caspase-3的水平。結(jié)果: 與對照組比較，胡桃醌對SKOV3細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度和時(shí)間的增加而增強(qiáng)(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測50 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h和48 h后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率均高于對照組(P<0.01)。胡桃醌顯著提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，上調(diào)細(xì)胞Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平。結(jié)論: 胡桃醌通過促進(jìn)SKOV3細(xì)胞ROS的積累誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長。

[關(guān)鍵詞]胡桃醌； 卵巢癌； 活性氧簇；細(xì)胞凋亡

人們很早就發(fā)現(xiàn)核桃楸樹皮、果皮具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用，在中國許多治療癌癥的驗(yàn)方中都含有核桃楸成分。胡桃醌(juglone)又名5-羥基-1, 4-萘醌，是一種天然環(huán)狀醌類，可從胡桃楸的葉及外殼中提取。目前已有報(bào)道胡桃醌具有抗肝癌、肉瘤、前列腺癌、白血病等作用[1-4]。胡桃醌是否能夠抑制卵巢癌細(xì)胞生長相關(guān)報(bào)道較少。本研究在體外利用胡桃醌刺激卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，通過檢測細(xì)胞增殖、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)等，探討胡桃醌對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抗腫瘤作用。

材料和方法

1材料和主要試劑

胡桃醌和溴化四氮唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2， 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT](Sigma)；活性氧檢測試劑盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(碧云天生物有限公司)；DMEM 培養(yǎng)基及胰酶(Gibco)；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自杭州四季青公司；細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體和活化caspase-3 抗體(Epitomics)。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。將人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞株于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用DMEM+10% FCS培養(yǎng)，隔日換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT比色法檢測SKOV3細(xì)胞的活力取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成SKOV3單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。加入胡桃醌培養(yǎng)液，每組設(shè)3復(fù)孔(終濃度分別為100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立正常對照組。體外培養(yǎng)24 h和48 h以MTT法測定吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3細(xì)胞死亡檢測取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成SKOV3單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。加入胡桃醌培養(yǎng)液，每組設(shè)3復(fù)孔(終濃度分別為100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)，同時(shí)設(shè)立正常對照組。將培養(yǎng)板中細(xì)胞用消化液消化并離心收集細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液，加100 μL 0.8%臺盼藍(lán)溶液，混勻，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，并重復(fù)3次，藍(lán)色的細(xì)胞被記為死亡細(xì)胞，迅速用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)平行孔，加入50 μmol/L胡桃醌，培養(yǎng)24 h后70%乙醇4 ℃固定過夜。上機(jī)前離心去除乙醇，PBS洗2次，加入含2% Triton X-100和50 mg/L RNase A 的PBS 100 μL，每孔加入PI溶液100 μL，4 h避光染色30 min，再加200 μL PBS將細(xì)胞懸起，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.5ROS活性的檢測終濃度為50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3細(xì)胞24 h后，棄培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋的DCF-DA(2 μmol/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，PBS洗3次，熒光顯微鏡(Olympus)觀察結(jié)果。使用圖像分析軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

2.6蛋白免疫印跡法檢測Cyt C和活化caspase-3蛋白水平終濃度為50 μmol/L胡桃醌刺激細(xì)胞24 h后，PBS 洗1次，加入細(xì)胞裂解液100 μL，加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解1 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，蛋白定量后，加入2×上樣緩沖液，煮沸5 min，12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，利用Cyt C和活化caspase-3特異性抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗檢測，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1胡桃醌對SKOV3細(xì)胞的生長抑制

不同濃度胡桃醌處理SKOV3細(xì)胞24 h和48 h后采用MTT法檢測各組吸光度。與對照組比較，胡桃醌對SKOV3細(xì)胞的活力具有明顯的抑制作用。隨著胡桃醌濃度和刺激時(shí)間的增加，SKOV3細(xì)胞活力逐漸降低,細(xì)胞死亡數(shù)量逐漸增高，見圖1。

Figure 1.The effect of juglone on the proliferation of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1胡桃醌對SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2Annexin V/PI 雙染色法檢測凋亡率

50 μmol/L的胡桃醌作用SKOV3細(xì)胞24 h和48 h后，通過Annexin V/PI雙染細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，對照組早期凋亡率分別為0.8%±0.1%和1.7%±0.1%；晚期凋亡率分別為1.8%±0.3%和3.6%±0.8%。實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率分別為19.7%±2.9%和8.9%±0.6%；晚期凋亡率分別為51.1%±4.7%和70.1%±5.9%，2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of juglone on the apoptosis of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2胡桃醌誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響

3胡桃醌對SKOV3細(xì)胞ROS水平的影響

熒光探針DCF-DA能夠被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成DCF，在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈正比。50 μmol/L胡桃醌作用SKOV3細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度為45.3±4.1，對照組熒光強(qiáng)度為21.7±1.9。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)。

4Western blot 檢測Cyt C和活化caspase-3的蛋白水平變化

50 μmol/L的胡桃醌處理SKOV3細(xì)胞24 h后，蛋白免疫印跡法檢測Cyt C和活化caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組比較Cyt C和活化caspase-3的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖 3。

討論

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科腫瘤第3位。然而卵巢癌的死亡率高居?jì)D科瘤首位，5年生存率仍然徘徊在30%左右[5]。因此，迫切需要尋找新的治療方法，以延緩復(fù)發(fā)和提高卵巢癌患者的生存率。我國的藥用植物物質(zhì)資源豐富，已發(fā)現(xiàn)含有抗癌活性成分的植物有200種左右。胡桃醌是從胡桃屬植物中的新鮮根皮、枝皮、青果皮中分離出來的羥基萘醌類化合物，能夠抑制細(xì)胞生長，具有抗腫瘤作用。因此，有必要研究對卵巢癌治療有效的藥物。

Figure 3.The effect of juglone on the protein levels of Cyt C and activated-caspase-3 in the SKOV3 cells. Meran±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3胡桃醌對SKOV3細(xì)胞Cyt C和活化caspase-3蛋白水平的影響

本研究通過不同濃度的胡桃醌作用于SKOV3細(xì)胞，采用MTT法測定細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)證明隨著胡桃醌濃度增加對SKOV3細(xì)胞抑制作用越顯著。流式細(xì)胞術(shù)分析其凋亡率發(fā)現(xiàn)，胡桃醌對SKOV3細(xì)胞抑制作用主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但機(jī)制不清。已有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系，其細(xì)胞凋亡過程多是由于氧化應(yīng)激引起。氧化應(yīng)激通過線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致 ROS 產(chǎn)生，細(xì)胞中 ROS 的增加被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的不利因素。ROS 是細(xì)胞內(nèi)氧分子還原而成的一系列具有強(qiáng)氧化活性的小分子，能夠引起線粒體的氧化損傷[6]。線粒體主要可發(fā)生線粒體膜電位下降，崩解；能量供給系統(tǒng)受損，轉(zhuǎn)運(yùn)小孔開放，膜間內(nèi)含物Cyt C 從線粒體中釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞漿中的Cyt C 能與凋亡相關(guān)因子1 結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9 與其結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)而激活下游caspase-3，引起級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。研究表明，一些藥物和小分子化合物可引起腫瘤細(xì)胞ROS的增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞影響較小[8]。一些藥物也正是基于這一理論而起到抗腫瘤作用的，例如三氧化二砷和二甲基雌二醇等皆通過增加胞內(nèi) ROS 而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胡桃醌刺激24 h后，SKOV3細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，與胡桃醌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在胡桃醌組Cyt C和活化caspase-3表達(dá)顯著高于對照組。因此，ROS的過度累積導(dǎo)致線粒體損傷可能是胡桃醌殺死腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一。

總之，作為一種高效的抗腫瘤藥物，胡桃醌能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)ROS的異常累積有密切關(guān)系。

[參考文獻(xiàn)]

[1]趙行宇，楊森，周麗霞，等. 胡桃醌對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 2(3):255-258.

[2]季宇彬，曲中原，鄒翔，等. 青龍衣中胡桃醌對S180肉瘤小鼠的抑瘤作用研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2009, 44(3):195-199.

[3]方芳，王立國，張巍，等. 胡桃醌對人前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制作用[J].中國公共衛(wèi)生, 2013, 29(10):1458-1460.

[4]Xu HL, Yu XF, Qu SC, et al. Juglone, fromJuglansmandshruicaMaxim, inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-dependent mechanism[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(3-4):590-596.

[5]Liu B, Nash J, Runowicz C, et al. Ovarian cancer immunotherapy: opportunities， progresses and challenges[J]. J Hematol Oncology, 2010, 3:7.

[6]楊朝，耑冰，張麗萍，等. 急性缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體活性氧變化的觀察[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(11):2009-2014.

[7]Zhivtovsky B, Orrenius S, Brustugun OT, et al. Injected cytochrome C induces apoptosis[J]. Nature, 1998, 391(6666):449-450.

[8]Kirshner JR, He S, Balasubramanyam V, et al．Elesclomol induces cancer cell apoptosis through oxidative stress[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(8): 2319-2327.

[9]Wang J, Yi J. Cancer cell killing via ROS: to increase or decrease， that is the question[J]. Cancer Biol Ther, 2008, 7(12):1875-1884.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of juglone in regulating oxidative stress and apoptosis in ovarian cancer SKOV3 cells

FANG Fang1, ZHAO Liang-zhong1, LI Qiang1, CHEN Shuang1, JIANG Xiao-ming1, ZHANG Duo1, WANG Li-guo2

(1DepartmentofImmunology,2AffiliatedHospital,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China.E-mail:urolancet@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the cytotoxicity of juglone on ovarian cancer SKOV3 cells. METHODS: The activity of SKOV3 cells was detected by MTT assay. The cells apoptosis was examined by flow cytometry. The level of reactive oxygen species (ROS) was measured by DCF-DA staining. The protein levels of cytochrome C (Cyt C) and activated caspase-3 were evaluated by Western blot. RESULTS: MTT assay showed that juglone significantly inhibited the growth of SKOV3 cells in dose- and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate and late apoptotic rate of SKOV3 cells in 50 μmol/L juglone group at 24 and 48 h were higher than those in control group (P<0.01).Moreover, juglone induced ROS accumulation, and increased the protein levels of Cyt C and activated caspase-3.CONCLUSION: Juglone inhibits the cell growth and induces the apoptosis of SKOV3 cells by ROS accumulation.

[KEY WORDS]Juglone; Ovarian cancer; Reactive oxygen species; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0156- 04

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 11- 03

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81202031);吉林市科技局基金資助項(xiàng)目(No. 2013625028)

通訊作者△Tel: 0432-64560741; E-mail: urolancet@sina.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.027