賴煥玲，　陳鵬宇，　段曉瑾，　徐偉君，　雷玉婧，　郭　茜，　吳清和，　黃　萍，　操紅纓

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006)

縮泉丸對膀胱過度活動癥大鼠膀胱充盈期盆神經放電的影響*

賴煥玲，陳鵬宇，段曉瑾，徐偉君，雷玉婧，郭茜，吳清和，黃萍，操紅纓△

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 研究縮泉丸對膀胱過度活動癥(OAB)大鼠膀胱容量、壓力及盆神經放電的影響，探討縮泉丸對OAB大鼠膀胱感覺功能的作用。方法： SD雌性大鼠分別進行膀胱出口梗阻手術以復制OAB模型，隨機分為OAB模型組、假手術組和縮泉丸高、中、低劑量組，給藥4周后，以尿動力儀觀察灌注過程中膀胱容量、壓力及非排尿性收縮的變化，以多通道生理記錄儀檢測灌注過程中盆神經放電的變化。結果： OAB大鼠盆神經放電模式表現(xiàn)為放電頻率先于壓力達到峰值，而后壓力達到峰值時，放電頻率趨于平臺或下降。OAB模型大鼠膀胱充盈過程中盆神經放電頻率明顯增強，膀胱壓力上升，容量增加，非排尿性收縮增多；縮泉丸的干預能降低盆神經的放電沖動，減少神經放電增強引起的逼尿肌非排尿性收縮，降低膀胱壓力，并呈劑量依賴性。結論： 縮泉丸對OAB大鼠膀胱感覺功能的調節(jié)可能是其治療OAB的機制之一。

[關鍵詞]縮泉丸； 膀胱過度活動癥； 膀胱出口梗阻； 盆神經放電

國際尿控協(xié)會(International Continence Society，ICS)把膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)定義為以尿急為主要表現(xiàn)，伴或不伴急迫性尿失禁的一種癥候群，常伴有尿頻和夜尿增多[1]。膀胱過度活動癥是一種常見的膀胱功能障礙，雖無生命危害，但嚴重影響患者的生活質量。以往對于OAB的發(fā)病機制存在3種主流的假說[2]：肌源性假說指產生不隨意逼尿肌收縮的必要條件是平滑肌的改變；神經源性假說指由于腦部或脊髓中樞抑制通路或者膀胱外周神經傳入末梢敏感性受到損害，使得原始排尿反射無法得到抑制，促使逼尿肌過度活動；膀胱的自主性假說認為任何能夠引起逼尿肌模塊間聯(lián)系增強的因素均易導致膀胱逼尿肌過度活動。研究發(fā)現(xiàn)，機械刺激或化學物質刺激引起膀胱傳入神經敏感性增強導致排尿反射亢進引起自主或不自主排尿，使得膀胱感覺功能成為另一個OAB的發(fā)病機制的研究熱點。正常的膀胱感覺功能實際上就是大腦皮層對來自下尿路傳入神經沖動的主觀感知[3]，是維持人體周期性儲尿與排尿的重要前提之一。神經傳導亢進會導致尿頻、尿急、尿痛和急迫性尿失禁等儲尿期癥狀[4]。

中醫(yī)以補腎縮尿為主要原則治療OAB相關癥狀，在臨床證實是一種行之有效的治療方法。縮泉丸(Suoquan Wan，SQW)是中醫(yī)傳統(tǒng)古方，由益智仁、烏藥和山藥組成，具有溫腎祛寒，縮尿止遺的功效，眾多臨床研究也表明以縮泉丸為代表的中醫(yī)補腎縮尿治療法在膀胱過度活動癥的臨床治療中取得了廣泛而可靠的療效，但縮泉丸干預膀胱過度活動癥的具體作用機制尚未十分明確。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，縮泉丸可以改善多尿[5]、調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸[6]；并能通過下調M3R及其介導的信號轉導通路和上調β3-AR及其介導的信號轉導通路[7-9]，從肌源性和神經源性兩個角度共同恢復逼尿肌舒縮功能。鑒于縮泉丸在臨床治療尿頻、遺尿、尿失禁等的顯著療效，本實驗以期通過觀察縮泉丸對OAB大鼠膀胱盆神經放電的影響，完善縮泉丸治療OAB的作用機制。

材料和方法

1動物、主要藥品與儀器

SPF級雌性SD大鼠，200～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(粵)2013-0020，合格證號為440005900000322；飼養(yǎng)條件采用12 h晝夜交替照明，濕度50%～70%，溫度(24±2)℃。動物實驗設施許可證號為SYXK(粵)2013-0085，使用證明號為00058727?？s泉丸膠囊為湖南漢森制藥有限公司產品；烏拉坦為國藥集團化學試劑有限公司產品；氯化鈉(NaCl)為天津市大茂化學試劑廠產品；BL-420E 型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)及電極(成都泰盟科技儀器有限公司)；WZ-50C6型微量注射泵(浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司)；Laborie UDS-94型尿動力學檢查儀(Laborie)；測壓導管為壓力感受器連接3F硬膜外麻醉導管。

2方法

2.1OAB模型大鼠的建立——膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction)手術SPF級雌性大鼠，體重220～240 g，采用近端尿道(膀胱頸)結扎法建立OAB模型。實驗方法：1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將直徑為1 mm的硬膜外導管經尿道外口插入膀胱，以此作為尿道支撐。取下腹部正中切口，切開皮膚及皮下組織，找到膀胱。膀胱頸近端尿道稍作分離，于此處穿過2-0絲線，結扎膀胱頸，結扎絲線的松緊標準以牽拉探子時周圍組織可隨之移動，而探子又可輕易拔除為度，然后拔除探子，逐層縫合關閉切口，適量使用抗生素。假手術組動物按照上述手術方法行開腹及近端尿道鈍性分離，但不行結扎梗阻實驗，作為對照。

2.2實驗分組及給藥將動物分為5組(每組10只)：假手術組、模型組和縮泉丸高、中、低劑量組。根據動物公斤體重劑量折算系數法，縮泉丸以臨床的10、5和2.5倍換算出1 170、585和293 mg·kg-1·d-13個給藥組的劑量，縮泉丸膠囊除去膠囊殼，將所含藥物粉末以蒸餾水配制成高、中、低3種濃度的藥液，溫水浸泡20 min，超聲10 min后使用，每次灌胃前振蕩混勻；假手術組和模型組給予同體積蒸餾水。手術3 d后進行給藥，持續(xù)4周。

2.3分離盆神經末次給藥后，參考文獻方法分離盆神經[10]：大鼠以25%烏拉坦(1.0 g/kg)全麻后，打開腹腔，暴露后腹膜和盆腔腹膜，沿盆神經節(jié)向中樞端分離盆神經。將腸道及一側子宮輕推至另一側后，可在髂血管分叉下方和膀胱后方形成一個類似三角形的凹陷空間，滴加 37 ℃溫石油浸泡盆神經，保溫防干，同時便于將盆神經懸掛于電極而不與周圍組織接觸。分離好的大鼠盆神經懸掛于雙鉤鉑絲電極，參考電極連接于皮膚。通過加熱墊將大鼠肛溫控制于37 ℃ 左右。

2.4膀胱容量、壓力及盆神經放電的記錄膀胱頂造瘺及測壓管連接：于膀胱頂切開一小口，插入3F導管，2-0絲線結扎。此過程中注意切勿夾持膀胱以免對膀胱壁造成損傷。導管連接T型轉換接頭，3F導管通過T型轉換接頭連接膀胱測壓管和灌注管，測壓管連接尿動力儀壓力傳感器，灌注管連接微量灌注泵。打開BL-420E型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，設置好實驗模式及測量參數如下：模式為生物電，采樣頻率10 kHz，掃描速度2.0 s/div，靈敏度20 μV，時間常數0.001 s，高頻濾波3 kHz，陷波50 kHz。連接電極，用螺旋調節(jié)器調整記錄電極與盆神經的接觸位置，觀察盆神經放電波形，以信噪比高、基線穩(wěn)定、干擾少為效果佳。記錄盆神經傳入放電前，用眼科彎鑷夾斷盆神經中樞端，減少中樞端傳入電活動的影響[1]。

2.5盆神經的定位及功能確認和參數記錄對膀胱進行緩慢灌注(30 μL/min)充盈，可誘發(fā)盆神經傳入放電頻率進行性增強，表明盆神經無明顯損傷，放電活動正常。而后排空膀胱，待盆神經自發(fā)傳入放電恢復至基線水平，再按100 μL/min速度進行灌注(每次灌注前需待神經放電恢復至基線水平)。

體內置零，灌注前記錄盆神經自發(fā)傳入放電基線開啟微量注射泵向膀胱內灌注生理鹽水，此過程中注意觀察尿道外口有無液體溢出。液體溢出時記錄的膀胱壓即為膀胱漏尿點壓(bladder leak point pressure，BLPP)；同時停止灌注，觀察膀胱壓力曲線，記錄其峰值，即為最大膀胱排尿壓(maximum voiding pressure，MVP)；記錄灌注過程中非排尿性收縮次數(non-vioding contraction，NVC)；記錄此過程中膀胱神經傳入電活動，即盆神經放電，包括基線值及最大放電頻率(maximum firing frequency)，直至排尿過程完成后停止。計算膀胱最大容量(maximum bladder capacity，MBC),公式為：MBC=灌注時間×灌注速度。

2.6放電頻率分析用BL-420E多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，基線記錄60 s 內的平均放電頻率作為基線值，充盈過程中放電頻率最大值(10 s內平均值)減去基線值作為平均放電頻率(mean firing frequency,MFF)，以1∶1信噪比行閾值分析。

3統(tǒng)計學處理

計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行完全隨機設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)和非參數檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1縮泉丸對大鼠膀胱充盈期盆神經傳入電活動的影響

以生理鹽水充盈膀胱，與假手術組相比，OAB模型大鼠盆神經放電明顯增強；與模型組相比，縮泉丸高劑量組神經放電明顯減少，中、低劑量組有所減少，但差異未見統(tǒng)計學意義，見圖1。

Figure 1.The effect of SQW on pelvic nerve firing in OAB model rats. Mean±SD.n=8～10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsOAB group.

圖1縮泉丸對大鼠在膀胱充盈期盆神經傳入電活動的影響

2假手術組與模型組灌注過程中盆神經放電及膀胱壓力圖的變化

本實驗采用BL-420E生理儀記錄膀胱充盈過程中的盆神經放電變化，同時使用尿動力學檢測儀同步檢測膀胱壓力變化。實驗結果示例圖見圖2、3。盆神經放電模式為膀胱充盈期間，在膀胱壓力急劇上升之前，傳入神經放電持續(xù)而緩慢；當膀胱壓力達到排尿閾值，盆神經放電的頻率及幅度均先于膀胱壓力達峰，致使膀胱排尿。OAB模型大鼠盆神經放電-膀胱壓力檢測結果與假手術大鼠的檢測結果比較，OAB大鼠充盈期間神經沖動發(fā)生頻率增加，而由于梗阻導致膀胱功能受損，逼尿肌不穩(wěn)定收縮頻率上升但未達到排尿所需的壓力；排尿發(fā)生后，神經放電下降但仍有小幅度的沖動發(fā)生，推測由于殘余尿量的刺激，導致放電的增加使得逼尿肌收縮以期排除殘余尿，但由于排尿后膀胱能量損耗，收縮壓力不足，殘余尿量未能排盡。此循環(huán)導致排尿間隔縮短，下一排尿周期提前，若不及時解除梗阻進行治療，膀胱功能及盆神經感覺功能均會受到嚴重損傷。

Figure 2.Pelvic nerve firing during bladder intravesical instillation in sham group.

圖2假手術組大鼠膀胱充盈過程中神經放電示例圖

Figure 3.Pelvic nerve firing during bladder intravesical instillation in OAB group.

圖3OAB模型組大鼠膀胱充盈過程中神經放電示例圖

3縮泉丸對大鼠膀胱充盈期膀胱壓力、容量及非排尿收縮的影響

與假手術組相比，OAB模型大鼠BLPP和MVP明顯升高，MBC明顯增大，NVC明顯增多；與模型組相比，縮泉丸各劑量組BLPP和MVP明顯下降，MBC明顯減少，高、中劑量組NVC明顯減少,見表1。

表1　縮泉丸對大鼠在膀胱充盈期膀胱壓力、容量及非排尿性收縮的影響

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsOAB.

討論

膀胱由復雜且分布廣泛的神經支配。交感神經和副交感神經傳出纖維分別通過下腹神經和盆腔內臟神經傳至膀胱和尿道。根據膀胱不同組織結構對機械刺激的反應，盆神經可以區(qū)分為支配肌層、支配尿路上皮、支配肌層及上皮層、支配漿膜層共4支。已有研究顯示，參與膀胱機械感覺功能的傳入神經主要是腰部內臟神經(lumbar splanchnic，LSN)及盆神經(pelvic nerve, PN)。而研究區(qū)分出4類型的傳入神經纖維中有3類在2種神經通路中均表達，并參與調節(jié)排尿反射。在膀胱充盈過程中，可能存在3 種明顯的感覺[11]：充盈初感、初排尿欲、強烈排尿欲。與排尿欲相關的沖動走行于盆神經內，排尿欲望來自于膀胱壁的牽張。膀胱的機械敏感性所表現(xiàn)出的靜態(tài)和動態(tài)的變化以及在絕對水平上對尿液形成的反應依賴于逼尿肌在低速膨脹過程中的適應性變化。膀胱膨脹(充盈)速度可以嚴重影響膀胱測壓的測定結果[12]。Shea 等[13]的研究也曾采用生理鹽水以100 μL/min的速度模擬生理性充盈進行大鼠膀胱灌注。本研究通過預實驗并參考國外相關研究確定了灌注的方法及速度，采用造瘺法，以100 μL/min的速度進行灌注[10]，以期減少由于灌注速度對膀胱壁帶來的刺激而影響實驗結果的真實性。模型動物出現(xiàn)膀胱壓力、容量增大，儲尿期膀胱不穩(wěn)定收縮明顯增加，且神經放電增強，說明模型已經形成。

電生理學實驗在貓和大鼠身上發(fā)現(xiàn)了神經傳入電活動對正常膀胱功能的重要性。在正常情況下，膀胱傳入電活動主要受細小的有髓鞘的Aδ 纖維的調節(jié)。這些傳入纖維通過髓鞘到達腦干周圍神經灰質，此處正是感受膀胱充盈與否的中樞區(qū)，調節(jié)著排尿反射。另一種傳入神經纖維——無髓鞘的C纖維，在正常情況下，大多數的C纖維并不活躍，但大多數的C纖維可被化學物質激活，導致膀胱收縮等反應[14]。Birder 等[15]采用動物在麻醉狀態(tài)下進行實驗，顯示出C 纖維對造瘺膀胱膨脹無明顯的反應，但認為感覺傳入電活動的小幅度降低可能是由C 纖維引起的，其機制尚未明確。

本實驗采用多通道生理記錄儀研究OAB及縮泉丸干預后的大鼠在麻醉情況下的盆神經放電信號變化，實驗結果顯示，膀胱對機械牽張的反應主要表現(xiàn)為隨著灌注的進行，膀胱感受到膨脹牽張，起初神經放電隨著膀胱壓力的增大僅有小幅度增加，在膀胱壓力急劇上升之前，傳入神經放電的增加都顯得持續(xù)而緩慢。當膀胱壓力達到排尿閾值，盆神經放電的頻率及幅度均大幅度增加，致使膀胱排尿。該結果與目前的研究相類似[16-17]。即放電頻率先于壓力達到峰值，而后壓力達到峰值時，放電頻率趨于平臺或下降；OAB模型大鼠膀胱充盈過程中盆神經放電頻率明顯增強，提示神經反射亢進，可導致非排尿性收縮增加，膀胱壓力增大，該結果與目前國內外研究結果相似?？s泉丸的干預能明顯降低盆神經的放電沖動，減少神經放電增強引起的逼尿肌不穩(wěn)定收縮及排尿壓力，并能減少膀胱容量，利于尿液及時排出，其作用呈劑量依賴性。上述結果揭示縮泉丸對盆神經放電的調節(jié)，對膀胱感覺功能的作用可能是其治療OAB的作用機制之一。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of Suoquan Wan on bladder pelvic nerve firing during intravesical instillation of OAB rats

LAI Huan-ling, CHEN Peng-yu, DUAN Xiao-jin, XU Wei-jun, LEI Yu-jing, GUO Qian, WU Qing-he, HUANG Ping, CAO Hong-ying

(GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:hongyingcao@yahoo.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of Suoquan Wan (SQW) on bladder volume, pressure and pelvic nerve firing in overactive bladder (OAB) rats. METHODS: The OAB rat model was established by bladder outlet obstruction, and the rats in sham group received sham surgery. The OAB rats were randomly divided into OAB model group, high-dose SQW group, middle-dose SQW group and low-dose SQW group. After 4 weeks of treatment, an aerodynamic instrument was used to measure the pressure, volume and non-voiding contraction of all the rats. The pelvic nerve firing signal was recorded by the BL-420E multichannel recorder. RESULTS: The frequency of pelvic nerve firing increased to the peak before pressure. When the pressure reached the peak value, the firing signal remainded or reduced. The firing, pressure, volume and non-voiding contraction in the OAB model rats were significantly increased compared with the sham rats. After treated with SQW, the firing and pressure was dose-dependently decreased. CONCLUSION: The regulatory effect of SQW on the pelvic nerve may be one of the mechanisms for treating OAB.

[KEY WORDS]Suoquan Wan; Overactive bladder; Bladder outlet obstruction; Pelvic nerve firing

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0151- 05

[收稿日期]2015- 06- 15[修回日期] 2015- 08- 28

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81202982)

通訊作者△Tel： 020-39358086; E-mail: hongyingcao@yahoo.com

[中圖分類號]R363; R285.5

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.026