應(yīng)麗麗，　倪瑾瑤，　李慧敏，　余　霞，　陳　霖，　陳三妹，　陳國榮△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325015; 2紹興文理學院醫(yī)學院，浙江 紹興 312000)

姜黃素類似物L6H4對2型糖尿病大鼠心肌的保護作用*

應(yīng)麗麗1，倪瑾瑤1，李慧敏1，余霞1，陳霖1，陳三妹2△，陳國榮1△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325015;2紹興文理學院醫(yī)學院，浙江 紹興 312000)

[摘要]目的： 探討姜黃素類似物L6H4對2型糖尿病心肌病大鼠的保護作用及機制。方法: 雄性SD大鼠40只，隨機均分為正常對照(NC)組、高脂(HF)組、高脂治療(FT)組、糖尿病(DM)組和糖尿病治療(DT)組。采用高脂飲食加鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病模型，用L6H4治療8周。生化法測血糖及血脂水平，ELISA法測血清脂聯(lián)素(APN)水平，放射免疫法測大鼠血清胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，Masson染色和電鏡觀察心肌形態(tài)改變，免疫組化測心肌脂聯(lián)素受體1 (AdipoR1)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)蛋白的表達。Western blot法檢測大鼠心肌內(nèi)AdipoR1蛋白表達量。結(jié)果: HF組及DM組大鼠血糖、血脂、胰島素、HOMA-IR及TGF-β1蛋白水平較NC組均有升高，L6H4治療后均下降；HF組及DM組大鼠血清APN水平及心肌AdipoR1較NC組均有下降，L6H4治療后均升高。DM組和HF組大鼠心肌纖維化，線粒體腫脹，嵴紊亂，部分消失，經(jīng)L6H4干預后，大鼠心肌的形態(tài)學損害明顯減輕。結(jié)論: L6H4對2型糖尿病大鼠的心肌具有保護作用；血清APN濃度增加，心肌AdipoR1蛋白表達增強，及APN抑制TGF-β1的表達可能參與其中。

[關(guān)鍵詞]糖尿??； 心?。?姜黃素類似物L6H4； 脂聯(lián)素； 脂聯(lián)素受體1； 轉(zhuǎn)化生長因子β1

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是2型糖尿病患者死亡的重要原因。DCM發(fā)病機制尚不明確，可能的機制包括心肌纖維化、胰島素抵抗、高血糖誘導的代謝紊亂等，其特征性病變之一為心肌纖維化。已有研究表明脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是一種由脂肪細胞分泌的具有抗炎、抗動脈粥樣硬化以及胰島素增敏效應(yīng)的細胞因子；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是一種重要的致纖維化因子，與各臟器的纖維化密切相關(guān)。L6H4已被證實具有抗炎、降血糖、抗氧化等廣泛藥理作用，但目前關(guān)于L6H4在防治糖尿病心肌病的研究鮮有報道。本實驗通過研究L6H4對高脂血癥及糖尿病大鼠APN、脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)及TGF-β1的影響和機制，為糖尿病心肌病的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

1動物分組與處理

SPF級雄性SD大鼠40只(購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心)，體重180～220 g，隨機均分為5組：正常對照(normal control，NC)組、高脂(high-fat，HF)組、高脂治療(high-fat treatment，F(xiàn)T)組、糖尿病(diabetes mellitus，DM)組和糖尿病治療(diabetes treatment，DT)組，后4組高糖高脂飼養(yǎng)[1](飼料配方含10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽和66.5%常規(guī)飼料)。喂養(yǎng)4周以后，DM組及DT組禁食12 h后按30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病，72 h及 1 周后檢測尾靜脈空腹血糖，血糖值>16.7 mmol/L為造模成功，NC組、HF組和FT組腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。造模成功后，后4組繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，F(xiàn)T組及DT組用0.2 mg· kg-1· d-1姜黃素類似物L6H4溶于1%羧甲基纖維素鈉灌胃，其余組別按同等劑量羧甲基纖維素鈉灌胃，每天1次，并每日稱重，持續(xù)8周。

2藥品與主要試劑

姜黃素類似物 L6H4為溫州醫(yī)科大學藥學院梁廣教授惠贈。血清脂聯(lián)素ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；胰島素放免試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；兔抗鼠AdiopR1單克隆抗體購于Abcam；兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體和山羊抗兔單克隆抗體(II抗)PV6001均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3實驗方法

3.1血糖、血脂等相關(guān)指標的檢測第12周末，禁食12 h后，股動脈放血處死大鼠，收集血清。微量血糖儀測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)值，全自動生化分析儀檢測各組大鼠甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。ELISA測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。雙抗體夾心ABC-ELISA法測血清APN水平。

3.2標本處理及光鏡標本制備SD大鼠處死后，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干水分后稱重并計算心指數(shù)。心臟重量指數(shù)=心臟重量(mg)/體重(g)。取部分左心室肌以4%甲醛固定用于常規(guī)切片。為了觀察心肌間質(zhì)膠原纖維分布情況行Masson染色，按文獻[2]方法進行。

3.3免疫組化實驗檢測AdipoR1及TGF-β1蛋白的表達情況，AdipoR1抗體和TGF-β1抗體按1∶100濃度稀釋，采用EnVision二步法，并隨機選擇10個高倍鏡視野(×400)，通過圖像分析系統(tǒng)計算蛋白平均吸光度值(A值)。

3.4電鏡標本制備具體步驟參見參考文獻[3]。

3.5Western blot 實驗提取左心室心肌組織總蛋白，用Bradford法檢測蛋白含量。取50 μg蛋白，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入 I 抗AdipoR1(1∶1 000)4 ℃過夜。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。以GAPDH抗體作為內(nèi)參照,用Bio-Rad Quantity One 4.6凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各條帶進行相對定量分析。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及相關(guān)性分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1一般情況

在整個實驗過程中，NC組及高脂實驗組大鼠飲食、飲水、活動及大小便情況均正常，毛發(fā)光澤順滑；DM組大鼠體重減輕，行動遲緩，毛發(fā)失去光澤、干燥、色黃，精神萎靡；經(jīng)L6H4干預后，DT組大鼠一般情況較DM組明顯好轉(zhuǎn)。

2體重及心臟指數(shù)

分組前各組體重差異無統(tǒng)計學意義，實驗結(jié)束時，與NC組相比，DM組體重明顯減輕(P<0.01)；經(jīng)L6H4治療8周后， DT組體重增加(P<0.01)。實驗結(jié)束后，DM組大鼠心臟重量指數(shù)與正常組相比明顯增高(P<0.01)；L6H4干預后，DT組心臟重量指數(shù)明顯下降(P<0.01)，見表1。

表1各組大鼠體重及心臟重量指數(shù)比較

Table 1.Comparison of the body weight and the heart index of the rats with different treatments (Mean±SD.n=8)

Group Bodyweight (g) Heartweight (mg)Heartindex(mg/g)NC362.25±18.621166.25±62.783.22±0.15HF418.88±24.90**1457.50±198.04*3.47±0.37FT351.75±19.68##1122.50±102.92#3.19±0.25DM245.13±9.00**1050.00±29.76**4.29±0.07**DT309.25±13.95△△1203.75±42.74△△3.89±0.08△△

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3各組FBG、FINS、HOMA-IR、血脂和APN的檢測

3.1各組FBG、FINS及HOMA-IR檢測實驗結(jié)束時，與NC組相比，HF組及DM組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR均有不同程度增高，經(jīng)L6H4干預后，F(xiàn)T組及DT組的上述指標均下降，提示姜黃素類似物L6H4具有降低血糖及增加胰島素敏感性的作用，見表2。

表2各組血糖、血脂及胰島素抵抗指數(shù)的比較

Table 2.The changes of FBG, FINS and HOMA-IR in the rats with different treatment (Mean±SD.n=8)

GroupFBG(mmol/L)FINS(mIU/L)HOMA-IRNC6.73±0.5117.54±3.165.26±1.13HF10.61±1.04**23.07±4.23**10.86±2.17**FT7.66±0.66##19.98±3.286.81±1.31##DM30.47±1.82**31.14±1.89**42.07±1.85**DT13.73±1.15△△25.00±1.94△△15.20±1.06△△

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3.2各組大鼠血脂水平的比較實驗結(jié)束時，HF組及DM組大鼠血清中TG、TC的濃度及LDL-C/HDL-C值較NC組均顯著升高(P<0.01)，經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組及DT組上述指標均有下降(P<0.01)，提示L6H4有降脂作用，見表3。

表3　各組大鼠血脂的比較

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHF group;△△P<0.01vsDM group.

3.3血清APN水平檢測及血清APN水平與FBG、FINS、HOMA-IR、血脂水平相關(guān)性分析實驗結(jié)束時，HF組及DM組血清APN水平與NC組相比明顯降低(P<0.01)；DM組病變更嚴重，經(jīng)L6H4治療后，F(xiàn)T組血清的APN水平上升，但差異無統(tǒng)計學意義；DT組血清的APN水平明顯上升(P<0.01)，見圖1。相關(guān)分析表明，大鼠血清的APN水平與FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC及LDL-C/HDL-C水平均呈負相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為-0.656、-0.556、-0.627、-0.728、-0.820和-0.664，P<0.01)，提示血清APN水平與糖尿病糖脂代謝及胰島素抵抗密切關(guān)系。

4Masson染色觀察心肌改變

心肌Masson染色光鏡顯示，NC組及FT組大鼠心肌肌束排列整齊，血管壁周圍及心外膜僅見少量膠原纖維分布，其余部位未見明顯沉積；HF組大鼠心肌肌纖維排列尚整齊，血管壁周圍及間質(zhì)見較多量膠原纖維沉積(P<0.01)；DM組肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)見大量亮綠色膠原纖維沉著(P<0.01)；L6H4治療后，HF組和DT組心肌的上述病變明顯減輕(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.Comparison of the serum concentrations of APN in the rats with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.05vsDM.

圖1各組血清脂聯(lián)素水平的比較

5心肌AdipoR1與TGF-β1的表達情況及其相關(guān)性分析

免疫組化結(jié)果顯示，NC組大鼠心肌AdipoR1呈彌漫強陽性表達，HF組陽性表達較NC組下降(P<0.01),DM組蛋白表達強度明顯下降(P<0.01)；L6H4治療后，F(xiàn)T和DT組心肌AdipoR1蛋白的表達升高，但仍低于NC組(P<0.01)，與Western blot法檢測心肌AdipoR1蛋白表達的結(jié)果相符，見圖3、4。

Figure 2.The morphological changes of the myocardial tissues of the rats with different treatments (Masson staining, ×100). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

圖2大鼠心肌的Masson染色觀察

Figure 3.The expression of AdipoR1 and TGF-β1 in the rat myocardium with different treatments detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=8.**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

圖3免疫組化比較各組大鼠心肌AdipoR1和TGF-β1蛋白的表達

Figure 4.The expression levels of AdipoR1 in the rat myocar-dium with different treatments determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;△△P<0.01vsDM.

圖4Western blot檢測各組大鼠心肌內(nèi)AdipoR1蛋白的表達

免疫組化發(fā)現(xiàn)TGF-β1在5組心肌細胞胞漿內(nèi)均有表達，NC組大鼠心肌細胞的胞漿內(nèi)及周圍有少量散在的淡黃色物質(zhì)，呈弱陽性表達；與NC組相比，TGF-β1蛋白在HF組中表達強度增高(P<0.01)，在DM組心肌細胞及間質(zhì)細胞中呈強陽性表達(P<0.01)。經(jīng)L6H4干預后，F(xiàn)T和DT組TGF-β1蛋白含量明顯下降(P<0.01)。相關(guān)性分析表明，大鼠心肌AdipoR1的表達與血清APN水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.734，P<0.01)，與TGF-β1表達水平呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.760，P<0.01)。

6透射電鏡觀察心肌變化

心肌細胞超微結(jié)構(gòu)顯示，NC組的大鼠心肌粗細肌絲排列整齊，閏盤結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)完整；肌絲間見成行排列的線粒體，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴排列整齊、較密集。HF組大鼠心肌纖維排列尚整齊，粗細肌絲間隙略增寬，肌節(jié)結(jié)構(gòu)尚完整；線粒體略腫脹，線粒體嵴稍紊亂。L6H4干預后，F(xiàn)T組上述病變減輕。DM組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，心肌纖維排列紊亂，粗細肌絲間隙增寬，部分肌絲扭曲變形，甚至溶解消失，閏盤結(jié)構(gòu)模糊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清；線粒體腫脹明顯，線粒體嵴紊亂，部分消失；另見部分區(qū)大量膠原纖維沉積，提示心肌組織纖維化。DT組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)及線粒體形態(tài)較DM組明顯減輕，見圖5。

Figure 5.Ultrastructure of the rat myocardium in each group observed under transmission electron microscope (×10 000).

圖5大鼠心肌的透射電鏡觀察

討論

DCM是一種以心力衰竭為主要表現(xiàn)且與冠心病和瓣膜疾病無關(guān)的特異性糖尿病相關(guān)性心臟疾病，流行病學調(diào)查結(jié)果顯示患有糖尿病患者死于心血管系統(tǒng)疾病的人數(shù)是非糖尿病患者死于心血管系統(tǒng)疾病的2～3倍[4]。近年來研究者逐漸認識到在DCM的發(fā)展進程中心肌纖維化起著重要的作用[5]。

TGF-β1是重要的纖維化細胞因子，一旦失調(diào)，能夠增強心肌膠原基因的表達和心肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[6]，最終致使心肌細胞外基質(zhì)過度累積，從而引起心肌纖維化，與心室的結(jié)構(gòu)重建密切相關(guān)。Dasu等[7]研究表明，高血糖環(huán)境下可激活NF-κB，刺激TGF-β1的大量表達。Aragno等[8]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激通過增加NF-κB進入細胞核使得TGF-β1轉(zhuǎn)錄增多，致心肌纖維化。Ma等[9]報道IL-6可經(jīng)TGF-β1/Smad3途徑誘導CFs中膠原蛋白的合成，促進心肌纖維化。此外，研究表明，高脂血癥對心肌存在一定程度的損害，本實驗Masson染色發(fā)現(xiàn)HF和DM組大鼠心肌間及血管周圍膠原纖維含量明顯增加,透射電鏡發(fā)現(xiàn)心肌膠原蛋白沉積；免疫組化結(jié)果顯示HF和DM組大鼠心肌細胞及間質(zhì)TGF-β1的表達均顯著高于正常對照組。綜上所訴，證實TGF-β1在心肌纖維化中起了促進作用。

APN主要由脂肪細胞分泌，其受體AdipoR1，主要分布于骨骼肌、心肌等部位，兩者結(jié)合具有抗炎、抗動脈粥樣硬化及改善糖尿病癥狀等作用。Yan等[10]通過病例對照研究，發(fā)現(xiàn)患有心肌病的患者血清脂聯(lián)素水平明顯低于對照組，證實脂聯(lián)素與心肌纖維化具有相關(guān)關(guān)系。本實驗血清APN水平、心肌AdipiR1的表達與心肌TGF-β1的表達水平均呈負相關(guān)，可能通過多個途徑抑制TGF-β1。有體外心肌細胞培養(yǎng)實驗表明， APN可明顯增加高糖環(huán)境下的心肌細胞活性，并通過下調(diào)TGF-β1/Smads通路信號轉(zhuǎn)導，抑制TGF-β1的表達[11]。APN可以抑制NF-κB的激活，葡萄糖攝取，增加對胰島素的敏感性[12]。APN還能抑制氧化應(yīng)激及IL-6，進一步減弱TGF-β1致纖維化的危害。本實驗相關(guān)性分析表明血清APN水平與FBG、血脂水平、FINS及HOMA-IR均呈負相關(guān)關(guān)系，進一步證實了APN對DCM的防治作用。

近些年，大量研究顯示姜黃素不僅具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及對心血管系統(tǒng)等廣泛的藥理作用, L6H4為姜黃素類似物，比姜黃素具有更高的穩(wěn)定性。Asai等[13]研究推斷姜黃素可能通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體，增強APN啟動子活性，促進其分泌。胰島素抵抗時，炎癥因子IL-6、TNF-α等通過抑制APN啟動子活性降低APN在脂肪細胞的表達，是APN的重要調(diào)控因素。有研究[14]顯示姜黃素能抑制TNF-α誘導的HaCaT細胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，從而減弱IL-6和TNF-α對APN啟動子活性的抑制。Bharti等[15]用姜黃素處理細胞后能有效抑制NF-κB活化，從而抑制TGF-β1轉(zhuǎn)錄，這個過程可能沒有APN參與。L6H4治療下FT組及DT組的血糖、血脂下降，同時伴有胰島素抵抗改善。心肌纖維化是多種因素共同作用的結(jié)果，L6H4通過增加APN水平抑制TGF-β1這一途徑是目前糖尿病心肌病防治的新思路。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effects of curcumin analogue L6H4 on myocardial tissue of type 2 diabetic rats

YING Li-li1, NI Jin-yao1, LI Hui-min1, YU Xia1, CHEN Lin1, CHEN San-mei2, CHEN Guo-rong1

(1DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325015,China;2SchoolofMedicalSciences,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:csm498@163.com；chengr1978@aliyun.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effects of curcumin analogue L6H4 on the myocardial tissue of type 2 diabetic rats and its mechanism. METHODS: Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control (NC) group, high-fat (HF) group, high-fat treatment (FT) group, diabetes mellitus (DM) group and diabetes treatment (DT) group.The rats in the latter 4 groups were fed high-fat diet for 4 weeks, then the rats in DM groups and DT groups were intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ) to induce type 2 diabetes, while the rats in FT group and DT group were given L6H4. The blood glucose and lipid levels were detected by biochemical method, and serum adiponectin (APN) levels were detected by ELISA. The serum insulin levels were measured by radioimmunoassay and homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) were calculated. The morphological changes of myocardium were observed by Masson staining and electron microscopy. The protein expression of adiponectin receptor 1 (AdipoR1) and transforming growth factor β1(TGF-β1) in myocardial tissue were determined by immunohistochemistry. The protein expression of adipoR1 was also detected by Western blot for verification. RESULTS: Compared with NC group, the blood glucose, lipids, insulin, HOMA-IR and TGF-β1 were increased in HF and DM group, but they were decreased after treated with L6H4. Compared with NC group, the concentration of serum APN were decreased and the expression of AdipoR1 in the myocardium were weakened in HF group and DM group, and they increased after treated with L6H4. The myocardial fibrosis was obvious in HF group and DM group, the mitochondria in cardiomyocytes expanded, and the cristae disordered, partial disappeared. These lesions were significantly reduced after L6H4 treatment. CONCLUSION: L6H4 exerts a protective effect on the heart in type 2 diabetic rats. The increased concentration of serum APN, the enhanced expression of AdipoR1, and the expression of TGF-β1 inhibited by APN may be involved in the mechanism of protection．

[KEY WORDS]Diabetes mellitus; Myocardium; Curcumin analogue L6H4; Adiponectin; Adiponectin receptor 1; Transforming growth factor β1

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0027- 06

[收稿日期]2015- 08- 04[修回日期] 2015- 10- 14

*[基金項目]浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(No.2011C23123)；溫州市高層次人才創(chuàng)新技術(shù)項目

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[中圖分類號]R587.1; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.005