鐘鈞琳，　張艷玲，　趙云躍，　劉金來△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1超聲科， 2心內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

瑞舒伐他汀通過抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物受體改善晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞再內(nèi)皮化功能*

鐘鈞琳1，張艷玲1，趙云躍2，劉金來2△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1超聲科，2心內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 研究C反應(yīng)蛋白(CRP)對(duì)晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)表達(dá)的影響，并探討瑞舒伐他汀是否改善CRP誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞再內(nèi)皮化功能。方法: Western blot檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá)情況，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力、Transwell小室檢測(cè)遷移能力及黏附能力來觀察瑞舒伐他汀對(duì)于CRP誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞再內(nèi)皮化功能的影響。結(jié)果: 隨著CRP刺激濃度增加，RAGE蛋白表達(dá)量逐漸增加；而瑞舒伐他汀預(yù)孵育后，RAGE表達(dá)量逐漸下降。瑞舒伐他汀對(duì)于CRP誘導(dǎo)后的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞活性沒有顯著改變；而遷移能力和粘附能力均隨著瑞舒伐他汀濃度逐漸增加而增加，其中10-6mol/L瑞舒伐他汀組與CRP對(duì)照組比較均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論: CRP上調(diào)晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞RAGE的表達(dá)，瑞舒伐他汀可通過抑制RAGE表達(dá)增強(qiáng)CRP誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和粘附能力，從而改善其再內(nèi)皮化功能。

[關(guān)鍵詞]晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞； C反應(yīng)蛋白； 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體； 瑞舒伐他??； 再內(nèi)皮化

動(dòng)脈粥樣硬化可累及心、腦、腎、下肢動(dòng)脈等全身多個(gè)部位，其病理基礎(chǔ)主要是血管損傷后內(nèi)皮功能不全及新生內(nèi)膜過度增生，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和修復(fù)間的動(dòng)態(tài)紊亂[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為一種能直接增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，分為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞和晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial outgrowth cells，EOCs)，其參與損傷后血管再內(nèi)皮化和成體血管形成的功能可能成為改善動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈狹窄和防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術(shù)后再狹窄的一個(gè)新方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3],EOCs比早期EPCs有更強(qiáng)的黏附能力，在體外血管形成能力上，EOCs要顯著強(qiáng)于早期EPCs。慢性血管內(nèi)皮損傷性疾病，如吸煙、年齡、高脂血癥、高同型半胱氨酸和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因素下，其外周血中EPCs數(shù)量減少、功能減退。關(guān)于CRP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有致炎作用的報(bào)道已較多，我們之前的研究證實(shí)CRP對(duì)EOCs同樣有致炎作用，但具體機(jī)制尚未明確[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)在慢性炎癥情況下，體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced end products，RAGE)表達(dá)會(huì)顯著升高，其與配體結(jié)合后可激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)基因表達(dá)及增加促炎癥因子釋放[5-6]，直接或間接參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。本研究的目的是探討RAGE是否介導(dǎo)CRP刺激后EOCs分泌炎癥因子表達(dá)的增加，以及他汀藥物對(duì)CRP誘導(dǎo)的EOCs再內(nèi)皮化功能的影響。

材料和方法

1主要材料與試劑

重組人CRP購(gòu)自Calbiochem；兔抗人RAGE多克隆抗體購(gòu)自CST；兔抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自PeproTech；HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG II抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-Rad；DAPI購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT購(gòu)自Sigma；Transwell小室購(gòu)自Costar；瑞舒伐他汀購(gòu)于南京德寶公司。

2方法

2.1人臍血EOCs的分離和培養(yǎng)及鑒定所有臍血均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院健康足月產(chǎn)孕婦臍帶血，分離方法和培養(yǎng)條件參考文獻(xiàn)進(jìn)行[5, 7]，且經(jīng)DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定及流式細(xì)胞術(shù)分析EOCs的 CD34、KDR、CD133、CD14、CD45、CD31和CD105表達(dá)情況。

2.2瑞舒伐他汀細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以每孔4×103密度將等量EOCs種入96孔板，實(shí)驗(yàn)共分為6組：空白對(duì)照組；10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L瑞舒伐他汀組；DMSO(瑞舒伐他汀的溶劑，濃度為1∶1 000，與10-5mol/L瑞舒伐他汀組DMSO濃度相同)組。24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h。吸棄上清液后每孔加入150 μL DMSO，避光充分振蕩15 min，上酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。

2.3Western blot分析檢測(cè)RAGE蛋白的表達(dá)按照以下情況分組：(1)CRP劑量依賴效應(yīng)：0、10、25和50 mg/L CRP處理細(xì)胞；(2)瑞舒伐他汀對(duì)RAGE蛋白表達(dá)的影響：分別用不同濃度瑞舒伐他汀(0、10-8、 10-7、 10-6mol/L)預(yù)孵育12 h再加50 mg/L CRP刺激24 h，另設(shè)不加處理的空白對(duì)照組。按常規(guī)方法收集蛋白，上樣50 μg，以110 V恒壓轉(zhuǎn)膜約90 min， I 抗為兔抗人RAGE多克隆抗體(1∶1 000)， II 抗為HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG(1∶2 000)，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑顯影，以兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶20 000)為內(nèi)參照進(jìn)行灰度掃描并分析。

2.4內(nèi)皮祖細(xì)胞活性的檢測(cè)以每孔4×103密度將等量EOCs種入96孔板，24 h后用0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀孵育EOCs 12 h，再加50 mg/L CRP刺激24 h，另設(shè)不加處理的空白對(duì)照組。后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h。吸棄上清液后每孔加入150 μL DMSO，避光充分振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。

2.5內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移功能的檢測(cè)予以0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分別預(yù)孵育EOCs 12 h，后均再加50 mg/L CRP刺激EOCs 24 h，另設(shè)不加處理的空白對(duì)照組。分別消化、計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度，以2×104個(gè)細(xì)胞(約300 μL細(xì)胞懸液)接種至Transwell小室上室，24孔板下室中加入含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)50 μg/L的EBM-2培養(yǎng)基500 μL，孵育24 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染核10 min。熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)。

2.6內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附功能的檢測(cè)予以0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分別預(yù)孵育EOCs 12 h，后均再加50 mg/L CRP刺激EOCs 24 h，另設(shè)不加處理的空白對(duì)照組。各組貼壁細(xì)胞胰酶消化后重懸于EBM-2培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度，每組以相同數(shù)目細(xì)胞種入包被有人纖維連接蛋白24孔板中，37 ℃孵育1 h，隨機(jī)取5個(gè)視野(×100)中的貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。主要統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間差異性比較采用單因素方差分析，Bonferroni法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1EOCs鑒定

熒光顯微鏡觀察，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞為正在分化的EOCs；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，可見干細(xì)胞標(biāo)志性抗體CD34陽(yáng)性而CD133陰性，內(nèi)皮細(xì)胞系標(biāo)志性抗體KDR、CD31和CD105陽(yáng)性，而單核巨噬細(xì)胞系標(biāo)志性抗體CD14和CD45陰性。

2CRP誘導(dǎo)EOCs RAGE蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示隨著CRP刺激濃度(10、25和50 mg/L)增加，RAGE蛋白表達(dá)量逐漸增加(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effects of CRP on the protein expression of RAGE in EOCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L.

圖1CRP對(duì)EOCs RAGE蛋白表達(dá)的影響

3瑞舒伐他汀的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀處理EOCs后，其增殖活性與空白組比較均未見明顯變化，而10-5mol/L瑞舒伐他汀處理EOCs則使其增殖活性明顯下降，與空白組比較具有顯著差異(P<0.05)；另一方面，配制瑞舒伐他汀的溶劑DMSO對(duì)于細(xì)胞的增殖活性沒有影響，而10-5mol/L瑞舒伐他汀濃度過高，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，見圖2。故以下各個(gè)實(shí)驗(yàn)中瑞舒伐他汀選取10-8、10-7和10-6mol/L 3個(gè)劑量干預(yù)細(xì)胞。

Figure 2.The cytotoxic effect of rosuvastatinin (Rosuv) on EOCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2不同濃度瑞舒伐他汀對(duì)EOCs的毒性作用

4瑞舒伐他汀下調(diào)CRP誘導(dǎo)的EOCs RAGE蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，CRP組細(xì)胞內(nèi)RAGE表達(dá)量升高(P<0.05)。而隨著瑞舒伐他汀濃度增加，各組RAGE表達(dá)量則逐漸下降，與CRP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effects of rosuvastatin (Rosuv) on the protein expression of RAGE in EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;#P<0.05vscontrol.

圖3瑞舒伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)EOCs RAGE蛋白表達(dá)的影響

5EOCs的體外功能實(shí)驗(yàn)

5.1細(xì)胞活力予以10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分別單獨(dú)孵育或與CRP共同孵育EOCs，均不影響其細(xì)胞活力，見圖4。

5.2遷移功能CRP刺激后EOCs遷移能力減退，而瑞舒伐他汀能改善CRP誘導(dǎo)后EOCs遷移能力，隨著他汀濃度增加，CRP刺激后的EOCs遷移能力逐漸增強(qiáng)，其中10-7mol/L和10-6mol/L組與CRP對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The effects of rosuvastatin (Rosuv) on the proliferation of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.

圖4不同濃度瑞舒伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)的EOCs細(xì)胞活性的影響

Figure 5.The effects of rosuvastatinin (Rosuv) on the migration of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;##P<0.01vscontrol.

圖5不同濃度瑞舒伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)的EOCs遷移能力的影響

5.3黏附功能倒置顯微鏡計(jì)數(shù)可見CRP刺激后EOCs貼壁數(shù)量較空白組明顯減少，而瑞舒伐他汀能增加CRP誘導(dǎo)后EOCs貼壁細(xì)胞的數(shù)量，隨著他汀濃度增加，EOCs貼壁數(shù)目逐漸增多，其中10-6mol/L與CRP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。這表明瑞舒伐他汀能改善CRP誘導(dǎo)后EOCs的黏附能力。

討論

從大量既往研究可知，在健康成年人體內(nèi)CRP分泌的基礎(chǔ)水平是獨(dú)立于其它危險(xiǎn)因素、能提示心血管疾病的危險(xiǎn)因素[8-9]。有研究表明CRP能刺激單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分泌一系列促炎因子[10]；我們之前的研究也證實(shí)CRP能刺激EOCs分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8, IL-8)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)[4]，表明CRP對(duì)EOCs亦具有致炎作用。本研究證明CRP能上調(diào)EOCs 的RAGE表達(dá)。RAGE在固有免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[11]，配體與RAGE結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12]，包括啟動(dòng)促炎因子分泌的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB途徑、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)通路及PI3K/Akt通路，故可推測(cè)CRP通過上調(diào)RAGE刺激EOCs分泌IL-8、MCP-1、VCAM-1及ICAM-1，導(dǎo)致EOCs對(duì)受損內(nèi)皮的歸巢、黏附能力下降，再內(nèi)皮化功能受損。

Figure 6.The effects of rosuvastatin(Rosuv)on the adhesion of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;##P<0.01vscontrol.

圖6不同濃度瑞舒伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)的EOCs黏附能力的影響

他汀類作為一種羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，許多大型隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)已證明不論一級(jí)還是二級(jí)預(yù)防他汀類都能明顯降低心血管危險(xiǎn)因素，而這些作用獨(dú)立于降血脂效應(yīng)，其中包括改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[13]、增加纖維蛋白溶解抗血栓[14]、抗炎作用等。Mahajan等[15]報(bào)道，CRP通過細(xì)胞CD32受體激活MAPK(ERK、p38和JNK)通路，從而促進(jìn)人白血病單核細(xì)胞RAGE和其配體EN-RAGE表達(dá)增加，參與炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化過程，而阿托伐他汀能降低CRP誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)過程發(fā)生發(fā)展。我們也證明了瑞舒伐他汀能抑制EOCs RAGE表達(dá)，從而改善CRP誘導(dǎo)的EOCs炎癥因子分泌情況。正如Szmitko等[16]所述，內(nèi)皮祖細(xì)胞能否歸巢、整合到缺血組織或受損血管處主要取決于其數(shù)量多少和細(xì)胞黏附性，本研究進(jìn)一步證明了瑞舒伐他汀能改善CRP所致的EOCs遷移功能及黏附功能減退，故達(dá)到了改善EOCs再內(nèi)皮化的功能。但本研究證明10-8、10-7和10-6mol/L的瑞舒伐他汀均對(duì)EOCs的活力沒有顯著影響，且對(duì)CRP刺激后的EOCs活力也沒有顯著影響，這與Chen等[17]研究報(bào)道的AGEs對(duì)EOCs活力的影響結(jié)果一致；而他汀類藥物能改善成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，可能與EOCs增殖能力較成熟內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)有關(guān)。10-5mol/L的瑞舒伐他汀會(huì)降低EOCs的活力，這與Weis等[18]證實(shí)的高濃度他汀導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制成血管功能的結(jié)論相一致。

綜上所述，我們首次在EOCs探討CRP對(duì)RAGE的影響，說明RAGE可能為CRP影響其功能的一個(gè)新靶點(diǎn)，且首次觀察到瑞舒伐他汀能抑制CRP誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)，減少CRP導(dǎo)致的炎癥因子分泌增加，且改善了EOCs遷移和黏附能力，最終促進(jìn)了EOCs再內(nèi)皮化功能，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治提供新的途徑。但有關(guān)RAGE下游信號(hào)分子的表達(dá)情況有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Rosuvastatin enhances reendothelialization of endothelial outgrowth cells induced by C-reactive protein through regulating receptor for advanced glycation end products

ZHONG Jun-lin1, ZHANG Yan-ling1, ZHAO Yun-yue2, LIU Jin-lai2

(1DepartmentofUltrasound，2DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of C-reactive protein (CRP) on the receptor for advanced glycation end products (RAGE) expression in human endothelial outgrowth cells (EOCs), and to investigate the improving effect of rosuvastatin on the reendothelialization of EOCs induced by CRP. METHODS: EOCs were treated with CRP at different concentrations, or pre-incubated with rosuvastatin at different concentrations and then stimulated with CRP. The protein expression of RAGE was detected by Western blot. MTT assay was used to determine the viability of EOCs, and Transwell assay was used to detect the cell migration and adhesion. RESULTS: The protein expression of RAGE increased after CRP stimulation in a dose-dependent manner, and significantly decreased by pre-incubated with rosuvastatin at different doses. After treatment with different doses of rosuvastatin, the in vitro functions (migration and adhesion) of CRP-induced EOCs were dose-dependently upregulated. However, no change of the cell viability was observed. CONCLUSION: CRP increases the expression of RAGE. Rosuvastatin may improve CRP-induced reendothelialization (migration and adhesion) of EOCs by inhibiting RAGE expression.

[KEY WORDS]Endothelial outgrowth cells; C-reactive protein; Receptor for advanced glycation end products; Rosuvastatin; Reendothelialization

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0015- 06

[收稿日期]2015- 07- 08[修回日期] 2015- 11- 02

*[基金項(xiàng)目]廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 07001556)

通訊作者△Tel： 020-85252168； E-mail： lj.lai@medmail.com.cn

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.003