展恩欣，　范昊昌，　陳曉鳳，　孫玉蘭，　杜云塞，　黃文秀，　楊娜娜△，　秦樹存△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 2護(hù)理學(xué)院，山東 泰安 271016; 3新泰市人民醫(yī)院，山東 泰安 271200)

▲并列第1作者

載脂蛋白A-I模擬肽L-4F減輕過氧化氫誘導(dǎo)的小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷*

展恩欣1,2▲，范昊昌1▲，陳曉鳳1,2，孫玉蘭3，杜云塞1，黃文秀1，楊娜娜1△，秦樹存1,2△

(泰山醫(yī)學(xué)院1山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)脈粥樣硬化研究所，2護(hù)理學(xué)院，山東 泰安 271016;3新泰市人民醫(yī)院，山東 泰安 271200)

[摘要]目的： 研究載脂蛋白A-I模擬肽L-4F是否減輕過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)氧化應(yīng)激損傷及其機(jī)制。方法: 通過密度梯度離心法分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，條件培養(yǎng)基EGM-2MV誘導(dǎo)分化培養(yǎng)EPCs。對(duì)培養(yǎng)EPCs先以PI3K/AKT抑制劑LY294002(30 μmol/L)干預(yù)2 h后加入L-4F(75 mg/L)4 h，再加入100 μmol/L H2O2 24 h。MTT 法檢測細(xì)胞活力，試劑盒檢測各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，以評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化與抗氧化平衡及脂質(zhì)過氧化程度；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；免疫印跡法檢測p-AKT蛋白水平。結(jié)果: L-4F預(yù)處理顯著抑制了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、SOD活性下降、MDA含量增加及細(xì)胞凋亡。H2O2下調(diào)p-AKT的蛋白水平，L-4F呈濃度依賴性地上調(diào)p-AKT的蛋白水平。LY294002抑制了L-4F減輕EPCs損傷的作用。結(jié)論: 載脂蛋白A-I 模擬肽L-4F部分通過PI3K/AKT通路減輕H2O2誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞]動(dòng)脈粥樣硬化； 載脂蛋白A-I 模擬肽； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 過氧化氫； 氧化應(yīng)激

心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)——?jiǎng)用}粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴(yán)重危害人類健康。研究表明，血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能異常是導(dǎo)致AS發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，因此受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)對(duì)于抑制AS病變的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。眾多研究表明，EPCs可以遷移到內(nèi)皮受損部位，介導(dǎo)內(nèi)皮的再生、促進(jìn)損傷血管的再內(nèi)皮化及缺血病變區(qū)的新生血管形成，在內(nèi)皮維護(hù)和修復(fù)中起必不可少的作用[1-3]。許多病理狀態(tài)下機(jī)體血管活性氧含量增加，產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮受損；同時(shí)嚴(yán)重影響EPCs的數(shù)量和功能[4]，使內(nèi)皮修復(fù)受損，進(jìn)而引起AS性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。因此保護(hù)EPCs免受氧化應(yīng)激損傷對(duì)抑制AS性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)血漿水平與AS性心血管疾病呈負(fù)相關(guān)，是抗AS的重要靶點(diǎn)。HDL具有促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等減輕AS發(fā)生發(fā)展的功能。HDL抗AS的作用與其主要結(jié)構(gòu)性蛋白載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)密切相關(guān)。L-4F是一種ApoA-I 模擬肽，研究證實(shí)L-4F通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇外排抑制AS的發(fā)生發(fā)展[6]；也可通過減少內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子的生成保護(hù)內(nèi)皮功能[7]，但L-4F對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞——EPCs的作用尚未明確。本文通過H2O2誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷模型，研究ApoA-I 模擬肽L-4F減輕EPCs氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制。

材料和方法

1材料與試劑

人淋巴細(xì)胞分離液(TBD)；人纖維連接蛋白(BD)；Dulbecco′s PBS(Gibco)；DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-labelled acetylated low-density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)和FITC-UEA-I(BTI)；EBM-2培養(yǎng)基(Lonza)；M199培養(yǎng)基(Thermo)；L-4F(中科亞光多肽服務(wù)公司)；四甲基偶氮唑藍(lán) [3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT]購自Sigma；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Gibco；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin/V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)； PVDF 膜(Millipore)；β-actin(北京中杉金橋)；AKT(Sigma)；p-AKT(Abcam)，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2方法

2.1小鼠骨髓來源EPCs的分離培養(yǎng)4周齡小鼠麻醉后斷頸處死，75%乙醇浸泡15 min；剪刀剪取股骨，用預(yù)冷的PBS溶液反復(fù)沖洗骨髓腔，直到?jīng)_洗液變?yōu)榍辶?；反?fù)吹打沖洗液，將混勻的沖洗液用100 μmol/L濾網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液，置于離心管中，再緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液(沖洗液與人淋巴細(xì)胞分離液體積比為1∶1)，20 ℃下2 000 r/min離心20 min；離心管中間乳白色云霧狀為單個(gè)核細(xì)胞，將其輕輕吸取到新的離心管中，用PBS溶液洗細(xì)胞沉淀2次；完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；接種于預(yù)先用人纖維連接蛋白包被的6孔板或培養(yǎng)瓶中，密度為1×106/cm2；3 d后更換培養(yǎng)基，去除非貼壁細(xì)胞，隨后每隔2 d更換含10%血清的EGM-2MV條件培養(yǎng)基 1 次。

2.2EPCs的雙熒光染色鑒定將爬片的EPCs與DiI-Ac-LDL(2.5 g/L)于37 ℃孵育2 h；然后用多聚甲醛(1%～2%)固定細(xì)胞，5 min后用PBS浸洗，再加入FITC標(biāo)記的荊豆凝集素(10 mg/L)于37 ℃孵育1 h，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用熒光顯微鏡或激光共聚焦觀察；顯示黃色熒光的為DiI-Ac-LDL陽性，顯示綠色熒光的為FITC-UEA-I陽性，兩者雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

2.3實(shí)驗(yàn)分組EPCs培養(yǎng)7 d后，用0.25% 胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以同等數(shù)量細(xì)胞接種于孔板中，實(shí)驗(yàn)前將含10%血清的EGM-2MV培養(yǎng)基換為不含血清的M199培養(yǎng)基，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)；L-4F組：培養(yǎng)基中分別加入10、25、50、75和100 mg/L的L-4F 24 h；H2O2組：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L的H2O224 h；L-4F+ H2O2組：培養(yǎng)基先加入25、50和75 mg/L的L-4F預(yù)處理4 h后，再加入100 μmol/L的H2O224 h；LY294002+L-4F+ H2O2組：培養(yǎng)基先加入LY294002 2 h預(yù)處理后，再加入75 mg/L的L-4F 4 h，最后加入100 μmol/L 的H2O224 h。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力將細(xì)胞以同等數(shù)量(1×104)接種于96孔板中， 按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 4 h后棄去上清，每孔加入DMSO 200 μL，搖床振蕩搖勻10 min，于波長490 nm 處測定各孔吸光度(A)。以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其A值占對(duì)照組A值的百分比表示。

2.5細(xì)胞上清液總超氧化物歧化酶活力的測定收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照說明書依次加液，37 ℃下水浴40 min；加入顯色液并混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各組吸光度值，每組重復(fù)測 1 次。根據(jù)吸光度值計(jì)算實(shí)驗(yàn)各組總SOD 活力。以對(duì)照組SOD活力為 100%，其余各組SOD活力以其占對(duì)照組的百分比表示。

2.6細(xì)胞上清液丙二醛含量的測定收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照說明書依次加液，95 ℃下水浴40 min，取出后流水冷卻，離心10 min(3 500～4 000 r/min)。取上清，于波長532 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各組吸光度值，每組重復(fù)測 1 次。根據(jù)吸光度值計(jì)算MDA含量。以對(duì)照組MDA含量為 100%，其余各組MDA含量以其占對(duì)照組的百分比表示。

2.7Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率收集各組細(xì)胞，于4 ℃離心5 min，1 200 r/min，冷PBS漂洗細(xì)胞2次。棄上清，將細(xì)胞重懸于100 μL binding buffer，各加入 5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻后室溫避光孵育15 min，再加入400 μL binding buffer，上流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson) 檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.8免疫印跡法檢測p-AKT蛋白水平按照RIPA蛋白提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量；加入4×上樣緩沖液，沸水浴5 min 使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE(10%分離膠)后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，3%脫脂奶粉封閉1～2 h后，分別用兔抗p-AKT(1∶300)、AKT(1∶2 000)和β-actin 抗體(1∶2 000)多克隆抗體4 ℃過夜，洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育1～2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示免疫條帶，暗室曝光， Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶A值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1EPCs的表型及鑒定

EPCs培養(yǎng)至第7天，倒置顯微鏡下顯示為針樣細(xì)胞，熒光顯微鏡下見DiI-Ac-LDL染色陽性細(xì)胞發(fā)橙黃色熒光，F(xiàn)ITC-UEA-I染色陽性細(xì)胞發(fā)綠色熒光，二者雙染陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，雙陽性率大于80%，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致，見圖1。

Figure 1.Identification of EPCs derived from rat bone marrow.MNCs isolated from mouse bone marrow showed the characteristics of EPCs. A: EPCs exhibiting spindle morphology cultured for 7 d in EGM-2MV medium (×20); B: EPCs binding FITC-UEA-I (×10); C: EPCs taking DiI-Ac-LDL (×10).

圖1小鼠骨髓來源EPCs的表型及鑒定

2L-4F對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，L-4F呈濃度依賴性上調(diào)EPCs細(xì)胞活力(P<0.05)；同時(shí)L-4F可減輕H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷，細(xì)胞活力明顯增加(P<0.05)，尤以75 mg/L L-4F組更為明顯(P<0.01)；但LY294002預(yù)處理明顯抑制了L-4F減輕H2O2誘導(dǎo)的EPCs細(xì)胞活力損傷的作用，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effects of L-4F on the viability of EPCs. The viability of cells under different treatments was measured by MTT assay and expressed as the percentage of control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH2O2group．

圖2L-4F對(duì)EPCs細(xì)胞活力的影響

3L-4F對(duì)培養(yǎng)基SOD和MDA水平的影響

如圖3所示，以75 mg/L L-4F 處理細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)基中SOD活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量有所降低，但不明顯；H2O2組培養(yǎng)基中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高；與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與H2O2組相比，L-4F預(yù)處理組SOD活力明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05)，尤以75 mg/L L-4F組更為明顯(P<0.01)。而LY294002預(yù)處理組與H2O2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Figure 3.The effects of L-4F on the levels of SOD and MDA in the culture medium.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH2O2group.

圖3L-4F對(duì)培養(yǎng)液SOD和MDA 水平的影響

4L-4F抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，75 mg/L L-4F處理細(xì)胞24 h，總細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組降低了23.9%(P<0.01)；100 μmol/L的H2O2處理EPCs 24 h 后，總細(xì)胞凋亡率明顯增加，為對(duì)照組的1.43倍(P<0.01)；而給予75 mg/L L-4F預(yù)處理4 h，則顯著減少H2O2所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其總細(xì)胞凋亡率較H2O2處理組降低了26.1%(P<0.01)；LY294002預(yù)處理則明顯抑制了L-4F的這種作用，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

Figure 4.L-4F restored H2O2-induced apoptosis in EPCs. The ratio of apoptotic cells stained with Annexin V-FITC and PI was detected by flow cytometry analysis.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group.

圖4L-4F減少H2O2誘導(dǎo)的EPCs 凋亡

5L-4F 抑制H2O2誘導(dǎo)p-AKT表達(dá)下調(diào)

與對(duì)照組比較，L-4F顯著上調(diào)p-AKT蛋白表達(dá)，尤以75 mg/L L-4F組更為明顯(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The effect of L-4F on p-AKT protein expression in EPCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5L-4F對(duì)p-AKT蛋白表達(dá)的影響

H2O2可明顯下調(diào)EPCs p-AKT的蛋白水平(P<0.01)，而L-4F顯著抑制H2O2所誘導(dǎo)的p-AKT蛋白水平下調(diào)，并且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The effect of L-4F on H2O2-induced p-Akt protein decrease in EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH2O2group.

圖6L-4F對(duì)H2O2所誘導(dǎo)的p-AKT蛋白表達(dá)的影響

LY294002預(yù)處理則顯著抑制L-4F誘導(dǎo)的p-AKT蛋白水平上調(diào)，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.LY294002 inhibits L-4F-induced up-regulation of p-AKT in the EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group．

圖7LY294002抑制L-4F誘導(dǎo)的p-AKT蛋白水平的上調(diào)

討論

內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙與AS的發(fā)病密切相關(guān)[8]，因此保護(hù)內(nèi)皮功能可以延緩AS的發(fā)生發(fā)展。自1997年Asahara等[9]首次分離出EPCs，人們對(duì)其進(jìn)行了大量研究。EPCs可分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，具有增殖、遷移、黏附和成血管等功能，內(nèi)膜受損傷時(shí)循環(huán)中的EPCs可歸巢到損傷部位修復(fù)受損內(nèi)膜，進(jìn)而減慢AS 的進(jìn)程[10]。然而許多血管疾病狀態(tài)下機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致EPCs數(shù)量的減少和功能的受損，在AS 病人中，EPCs 的數(shù)量與AS 嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[11]。

HDL通過逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、抗脂質(zhì)氧化、抗炎、抗血栓形成、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等功能發(fā)揮其抗AS 作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了HDL抗AS的新機(jī)制——調(diào)節(jié)干、祖細(xì)胞的功能。HDL通過PI3K/AKT通路促進(jìn)EPCs的增殖[12]、增加NO產(chǎn)量及促進(jìn)端粒酶激活[13]來延緩EPCs的凋亡發(fā)揮抗AS的作用。重組HDL能夠促進(jìn)EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞及缺血部位新血管生成[14]。ApoA-I作為HDL的主要蛋白成分，在其抗AS過程中發(fā)揮重要作用。但由于ApoA-I分子量較大，需要通過靜脈給藥；且制造困難、成本高昂。因此，分子量較小、生物活性相似的ApoA-I模擬肽成為近年來心血管疾病治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由18個(gè)氨基酸肽鏈片段合成的ApoA-I模擬肽L-4F和D-4F，因較高的生物活性及有利的理化特性，成為目前研究最為廣泛的ApoA-I模擬肽。ApoA-I模擬肽Rev-D4F抑制ApoE敲除鼠AS的發(fā)展[15]；且D-4F抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[16]。Zhang等[17]的研究顯示ApoA-I 模擬肽D-4F通過eNOS/NO通路促進(jìn)EPCs增殖、遷移、黏附。我們課題組研究發(fā)現(xiàn)Rev-D4F通過PI3K/AKT/eNOS通路提高EPCs的生物學(xué)功能[18]。

本研究以L-4F為研究對(duì)象，在H2O2誘導(dǎo)EPCs氧化應(yīng)激損傷模型基礎(chǔ)上，采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、SOD及MDA檢測試劑盒、免疫印跡法檢測L-4F對(duì)氧化損傷后EPCs凋亡、釋放 SOD、MDA及p-AKT蛋白水平的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以L-4F處理EPCs，顯著增加了EPCs細(xì)胞活力及培養(yǎng)基SOD活力，減少了凋亡比例，但對(duì)MDA的釋放無明顯影響；H2O2處理細(xì)胞24 h，EPCs細(xì)胞活力、培養(yǎng)基SOD活力顯著降低，MDA的釋放及凋亡比例顯著增加；L-4F預(yù)處理則明顯減輕了H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷。說明L-4F能有效拮抗H2O2誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)L-4F明顯上調(diào)EPCs p-AKT蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性；L-4F預(yù)處理也顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的EPCs p-AKT的蛋白水平的下調(diào)。而在加入PI3K/AKT抑制劑LY294002后明顯抑制了L-4F減輕H2O2誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷及上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的p-AKT蛋白表達(dá)降低的作用。提示L-4F的這種保護(hù)作用部分通過PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，ApoA-I 模擬肽L-4F部分通過PI3K/AKT通路減輕H2O2誘導(dǎo)的EPCs氧化應(yīng)激損傷。EPCs對(duì)許多疾病狀態(tài)下血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)至關(guān)重要，因此，L-4F對(duì)延緩內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的AS性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，為臨床抗AS治療提供了新的研究思路。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Apolipoprotein A-I mimetic peptide L-4F reduces hydrogen peroxide-induced injury of mouse bone marrow-derived EPCs

ZHAN En-xin1, 2， FAN Hao-chang1， CHEN Xiao-feng1, 2， SUN Yu-lan3， DU Yun-sai1， HUANG Wen-xiu1, YANG Na-na1, QIN Shu-cun1, 2

(1KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,InstituteofAtherosclerosis，2CollegeofNursing,TaishanMedicalUniversity,Taian271016,China;3XintaiPeople’sHospital,Taian271200,China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;benben1980@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect and underlying mechanism of apolipoprotein A-I mimetic peptide L-4F on mouse bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) injured by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The bone marrow-derived mononuclear cells of C57 mice were isolated by density gradient centrifugation and cultured in EGM-2MV medium. EPCs were pretreated with a PI3K inhibitor LY294002 (30 μmol/L) for 2 h, and then incubated with L-4F (75 mg/L) for 4 h, followed by the treatment with 100 μmol/L H2O2 for 24 h. MTT assay and flow cytometry with Annexin V/PI staining were used to detect cell viability and apoptosis. The extracellular superoxide dismutase (SOD) andmalondialdehyde (MDA) levels were measured to characterize the balance between oxidation and antioxidation, and lipid peroxidation. The protein level of phosphorylated AKT (p-AKT) was analyzed by Western blot. RESULTS: L-4F restored H2O2-induced decrease in EPCs cell viability and apoptosis, and inhibited H2O2-induced decrease in SOD activity and increase in MDA level in culture medium. In addition, H2O2inactivated p-AKT, which was significantly restored by L-4F. However, LY294002 inhibited the restoration of L-4F on EPCs impaired by H2O2. CONCLUSION: Apolipoprotein A-I mimetic peptide L-4F significantly reduced H2O2-induced mouse bone marrow-derived EPC injury partially through stimulating the PI3K/AKT signaling pathway.

[KEY WORDS]Atherosclerosis; Apolipoprotein A-I mimetic peptide; Endothelial progenitor cells; Hydrogen peroxide; Oxidative stress

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0001- 07

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 10- 21

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30971098);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. Z2008C03; No. ZR2012HL18);山東省教育廳科技計(jì)劃(No. J14LK03)

通訊作者△秦樹存 Tel: 0538-6222986; E-mail: shucunqin@hotmail; 楊娜娜 Tel: 0538-6225275; E-mail: benben1980@126.com

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.001

·論著·