繆茂軍　陳小武　曹學兵　陳志斌

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mTOR信號通路在左旋多巴誘發(fā)異動癥中的作用及機制研究

繆茂軍陳小武曹學兵陳志斌

570102?？冢Ｄ厢t(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科[繆茂軍陳志斌(通信作者)陳小武]；華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經內科(曹學兵)

【摘要】目的探討mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路的激活在左旋多巴誘發(fā)異動癥(L-Dopa Induced Dyskinesia，LID)大鼠紋狀體中的作用及機制。方法普通級SD雄性大鼠共54只，隨機分為5組，8只正常組(N組),剩下8只帕金森病(Parkinson's disease)模型；異動癥組10只、余均分為雷帕霉素(Rapamycin)作為藥物治療組即干預組和Rapamycin溶劑的對照組(C組)各14只；記錄下對照組與干預組的行為學并進行異動癥AIM評分，每周至少兩次；用western blot技術測定N組、PD組、LID、C組以及R組紋狀體組織的免疫印跡，驗證所用NMDA受體亞基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位點磷酸化及PSD-95、p-PSD95(S295)磷酸化位點的抗體特異性的變化。結果(1)對照組第1，3，5天時間點行為學AIM評分與干預組無差異(P>0.05),第8天時間點行為學AIM評分與對照組比較，干預組AIM評分有下降(P<0.01)，之后第9、10、13、16、18、21天2組仍然有明顯差異，干預組AIM評分無反彈上升現(xiàn)象。(2)LID組大鼠紋狀體PSD-95及p-PSD95(s295)表達水平較其他組高；干預后兩者的表達水平明顯下降(P<0.05)。PSD-95及p-PSD95(S295)在正常組表達水平最低，在異動癥組和對照組最高，無差異(P>0.05)；與正常組外其他組對比，干預組兩者的表達水平明顯下降(P<0.05)；干預組與正常組的表達水平無明顯差異(P>0.05)。(3)LID組、對照組NMDA受體亞基NR1(Ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)位點磷酸化的表達水平較干預組有所增高(P均<0.05)。結論(1)mTOR參與了LID的發(fā)病，應用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素對LID的治療有效。(2)大鼠紋狀體區(qū)的mTOR信號調理與LID的發(fā)生密切相關，mTOR激活對紋狀體突觸水平具有調節(jié)作用，可能通過依賴突觸分子PSD-95以及NMDAR各亞型的磷酸化水平導致突觸可塑性發(fā)生適應改變，最終產生和維持皮質紋狀體突觸“病理性LTP”，從而介導了LID發(fā)生。

【關鍵詞】異動癥帕金森病mTOR雷帕霉素紋狀體突觸可塑性

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.011

PD是中老年人常見的神經系統(tǒng)退行性運動障礙疾病，目前治療PD的主要手段就是多巴胺(dopamine，DA)替代療法，但長期服用后可能導致嚴重的并發(fā)癥，其中較常見又是最難處理的一種并發(fā)癥就是LID，一旦出現(xiàn)該癥狀就會長期保持，嚴重影響左旋多巴(L-DOPA)對PD的進一步治療，LID被認為是最普遍的限制PD治療療效的副作用[1]，臨床上處理尚無找到有效的辦法。LID的發(fā)生主要是由一些受體導致紋狀體的輸出的變化是從而造成紋狀體多巴胺受體(dopamine receptor，DR)波動性刺激并變化引起的，但確切的機制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)：在LID模型中，直接通路(興奮性)MSNs內哺乳動物mTOR(Mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路能夠被持續(xù)性的激活；然而阻斷 mTOR的信號通路轉導不影響L-DOPA對PD的治療作用，但是卻能夠明顯減輕LID[2-4]。

mTOR調節(jié)的蛋白質的合成在突觸可塑性調節(jié)中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，利用不同頻率刺激發(fā)現(xiàn)皮質紋狀體谷氨酸能纖維能誘發(fā)長期增益效應(LTP)，皮質紋狀體通路異常在LID中起重要作用，即紋狀體神經元通過“病理性”LTP對異常運動的記憶，是LID產生的重要機制。在調節(jié)突觸可塑性中，皮質紋狀體突觸可塑性的異?？赡苁荓ID發(fā)生的重要機制。因此，關鍵分子PSD-95及骨架分子NMDA受體功能增強參與突觸可塑性，在“病理性LTP”產生中起重要作用[7]，但是mTOR在“病理性LTP”中的調控涉及到PSD-95、NMDA受體這一機制目前尚不清楚。

以上提示了mTOR在蛋白合成和LID中發(fā)揮了關鍵作用，突觸異常是LID發(fā)生的重要基礎，mTOR信號通路的激活在LID中發(fā)生，并可能成為治療LID的新靶標。因此，我們進一步猜想：作為與突觸可塑性相關的整合分子如PSD-95、NMDA受體。在LID中研究，mTOR信號通路的激活，導致與LTP產生和維持有關的蛋白質合成增加如PSD-95、NMDA各種亞型NR1、NR2A、NR2B的蛋白分子磷酸化表達等，mTOR通過調節(jié)蛋白質翻譯機制使突觸可塑性發(fā)生適應改變，最終產生和維持皮質紋狀體突觸“病理性LTP”，從而介導了LID發(fā)生，而這一系列的整合分子的表達是否受mTOR信號通路的調控呢？

本研究通過腦立體定向儀注射6羥基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制作性能穩(wěn)定的PD模型，對PD模型外源性輸入腹腔注射左旋多巴+芐絲肼制作LID模型，并且用mTOR特異性抑制劑-雷帕霉素干預，深入闡明mTOR信號通路在LID模型中發(fā)生的相關的行為學變化、突觸可塑性相關分子作用以及突觸形態(tài)學觀察，從而為行為學以及突觸可塑性分子水平奠定理論基礎。因此，本實驗通過驗證mTOR在LID模型中的作用，觀察mTOR信號通路的激活對LID大鼠行為學及PSD-95、S295、NMDAR亞基磷酸化水平的影響及調控，進一步探討LID的病理機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

飼養(yǎng)成年普通級Sprague-Daewley rats，雄性，體重從200～250 g范圍，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，遵照倫理學，所有飼養(yǎng)符合華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心標準和相關管理條例。

1.2實驗設計分組

設計分為5組：(1)正常觀察組(Normal，N組)，未做任何處理；(2)帕金森模型組(Parkinson,PD組)：6-OHDA(2 ug/ul，注射8 ug)腦立體注射制作，經阿撲嗎啡檢測制作成功的帕金森病大鼠便納入該組，后未做任何處理；(3)異動癥組(LID組)：經阿撲嗎啡(為0.05 mg/kg)檢測后選入成功的PD納入，L-DOPA +Benserazide (L-DOPA 25 mg+Benserazide 6.25 mg/kg，)腹腔注射給藥，連續(xù)21 d；(4)Rapamycin(劑量0.35 mg/kg用藥)為干預組(Rapamycin,R組)：Rapamycin干預后L-DOPA給藥；(5)Rapamycin的對照組(C組)：Rapamycin的溶劑(5% DMSO+5%聚乙二醇400+5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯溶液(Tween-20))作為對照，L-DOPA給藥不變。

1.3藥物及主要試劑

6-羥多巴(6-OHDA)、阿樸嗎啡、左旋多巴甲酯、鹽酸芐絲肼、雷帕霉素(rapamycin)、等均購于美國sigma公司。Anti-phospho -NR1 (Ser896) 購于 millipore公司；Anti-NMDAR2A(phospho Y1325)、Anti-NMDAR2B(phospho Y1472)購于Abcam；Anti-PSD95 (phospho S295)、Anti-PSD95 購于Epitomics；Anti-β-actin 購于santa。

1.4主要實驗器材

腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，超聲勻漿器、低溫離心機、電泳儀、-70 ℃超低溫冰箱等均由華中科技大學同濟醫(yī)學院神經系統(tǒng)重大疾病國家重點實驗室基礎醫(yī)學院9樓實驗室提供。

1.5偏側帕金森病大鼠模型的制備

以右側內側前腦束(MFB)為目標靶區(qū)，腦立體定向注射6-OHDA制作偏側帕金森病大鼠模型[8,9]。

1.6檢測PD模型

術后2周，使用阿撲嗎啡(0.05 mg/Kg)，旋轉>7轉/min 為成功的成功PD大鼠模型[10]。

1.7LID大鼠模型的制作(L-DOPA腹腔注射)

注射阿撲嗎啡3 d后，LID組大鼠給予溶液L-DOPA 25 mg+Benserazide 6.25 mg/kg于腹腔注射，1次/d，連續(xù)用藥7 d，評定等達到AIM[11]的標準。

Q：作為較早進入內地的香港企業(yè)，金杯印刷見證了改革開放的高速發(fā)展，您認為改革開放為貴公司提供了怎樣的發(fā)展環(huán)境？

1.8LID隨機分組

LID組：繼續(xù)每天L-DOPA給藥；R組大鼠每天在給予L-DOPA前1h給予Rapamycin；C組給予同等劑量的安慰劑(內含5% DMSO+5%聚乙二醇400+5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯溶液(Tween-20))，同時，如LID組所述，給予含L-DOPA+Benserazide溶液同劑量腹腔注射。

1.9異動癥(AIM)評分

AIM評分并錄取視頻交有課題負責人審校，評定標準按Monville等[11]標準， AIM目的評分分為4個部分：口面部-即下頜運動和嘴部舌頭伸出；上肢-即對側前肢重復無目的的動作；軸性-即頸部和對側上體的扭曲姿勢；運動-即與對側轉向運動)進行評定,數據順序亦按此記錄，每部分的評分等級根據行為學的有無及不自主運動的嚴重程度來劃分，共5個等級(0～4):0分為無出現(xiàn)；1分為偶爾出現(xiàn),少于50%的時間，即少于觀察期的一半；2分經常出現(xiàn)，超過50%的時間，即一半以上的觀察期；3分為繼續(xù)存在，刺激可以停止；4分為持續(xù)存在,刺激不可使之停止。從理論上評論每只大鼠，1只大鼠1次用藥后每個評分時間點最大得分為16分，120 min內最大評分為64分。記錄數據以供進一步分析。

1.10Western-Blot檢測紋狀體PSD95、S295等表達：

在藥物干預的最后1 d準備凍存管，液氮等，異動癥組、干預組及對照組在給予L-DOPA藥物2 h后處理，快速斷頭，放入冰上操作，小心解剖出右側紋狀體，稱重后記錄下數據并置入EP管，液氮速凍，存于-80 ℃，正常組以及PD組的紋狀體標本采集同上。根據各組大鼠的總重量來配置RIPA裂解液的量，加入10倍的RIPA裂解工作液體積，研磨徹底，用超聲波破碎儀勻漿3 s停1 min，提取蛋白，用BCA法測定蛋白水平，根據樣品數量BCA試劑按體積比A∶B=50∶1，加入5x蛋白上樣緩沖液的量為按EP中蛋白樣品的體積1/4，充分混合，震蕩義震蕩5 min后，電磁爐設置100 ℃，待達到100 ℃時候，放入沸水中加熱10 min，冷卻，將樣本經10%的SDS-PAGE電泳分離膠進行分離后，將膠移入PVDF膜上，右上角缺失及標記處為正面，合起，恒流300 mA 2 h將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜結束，條帶放入在TBST中用搖床洗5 min，然后放入預先配置好5%的脫脂奶粉中，搖床1 h即封閉結束。稀釋一抗，開始一抗孵育4 ℃過夜，一抗孵育結束。TBST洗滌3*10 min或者5*6 min。稀釋二抗(用TBST稀釋，不回收)，開始孵育二抗，室溫下約1 h，二抗孵育結束。用TBST洗滌5*6 min。在暗室中按1∶1體積吸入ECL發(fā)光液A和B試劑，于EP管中充分混勻，將PVDF膜放入暗匣中曝光，掃描曝光，保存圖像，若果效果不好，用TBST洗3*5 min，用一抗二抗洗脫液洗5 min，再次封閉，重新孵育一抗過夜，繼續(xù)前面步驟。

1.11統(tǒng)計學處理

2結果

2.1行為學評分

如圖1示，隨機選8只對照組與8只干預組行為學評分，在第8 d之前兩組無明顯差異即第1,3,5 d時間點兩組間無差異(P>0.05)，根據實驗設計，第7 d藥物干預，經雷帕霉素干預后第二天即第8 d時間點即出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，后AIM評分持續(xù)下降未出現(xiàn)明顯反彈現(xiàn)像(表1)。

表1　2組行為學評分

注：與干預組比較，*P>0.05,#P<0.01

圖1 行為學趨勢 與干預組同時間點比較,*P>0.05,#P<0.01

2.2突觸可塑性骨架分子水平Western-Blot檢測

2.2.1突觸可塑性骨架分子p-PSD95(s295)水平的變化LID組大鼠紋狀體s295表達較正常組外的其他組高(P<0.05)；N組表達水平最低；LID組和C組(P>0.05)最高，兩者無明顯差異(P>0.05)；R組與C比較有差異(P<0.05)；R與N組比較無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 Westernblot檢測p-PSD95(s295)水平的變化 與同正常組比較,△P=0.011<0.05;同PD組比較,*P=0.176>0.05;與異動癥組比較,**P=0.904>0.05;與對照組比較,***P=0.013<0.05;與干預組比較,※P=0.075>0.05

2.2.2突觸骨架分子PSD-95水平的變化

PD組PSD-95表達水平與N組較高(P<0.05)；LID組較PD組表達較高(P<0.05)；LID組和C組(P>0.05)表達最高，兩者無明顯差異(P>0.05)；R組與C比較有差異(P<0.05)；R組與N組比較無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 Westernblot檢測PSD-95水平的變化 與正常組比較,△P=0.012<0.05;與帕金森組比較,*P=0.195>0.05;與異動癥組比較,**P=0.836>0.05;與對照組比較,***P=0.021<0.05;與干預組比較,※P=0.809>0.05

2.3突觸可塑性關鍵分子水平Western-Blot檢測

2.3.1mTOR信號通路激活導致的NMDA亞基NR1(ser896)磷酸化水平的變化PD組ser896磷酸化水平較N組高(P<0.01)；LID組較PD組高(P<0.05)；LID組和C組最高，無明顯明顯(P>0.05)；R組與C組差異明顯(P<0.01)(圖4)。

圖4 Westernblot檢測p-NMDAR1(Ser896)的水平的變化 與正常組比較,△P=0.002<0.01,與帕金森組比較,*P=0.013<0.05,與異動癥組比較,**P=0.932>0.05,與對照組比較,***P=0.003<0.01,與干預組比較,※P=0.070>0.05

2.3.2mTOR信號通路激活導致的NMDA亞基NR2A(Y1325)磷酸化水平的變化

PD組NR2A(Y1325)磷酸化水平與N組比較，兩者有明顯差異(P<0.05)；LID組與PD組比較，有明顯差異(P<0.05)；C組與LID組明顯無差異(P>0.05)；R組與C組比較有明顯差異(P<0.01)；R組比N組有明顯差異(P<0.01)(圖5)。

2.3.3mTOR信號通路激活導致的NMDA亞基NR2B(Y1472)磷酸化水平的變化

如圖6示，PD組NR2B(Y1472)磷酸化水平較正常組高(P<0.01)；LID組與PD組比較有差異(P<0.01)；LID組和C組無差異(P>0.05)；R組與C組比較明顯差異(P<0.01)；R組比N組比較有明顯差異(P<0.05)。

3討論

3.1mTOR與突觸后致密區(qū)骨架分子PSD-95及S295與LID發(fā)病機制

PSD-95是在突觸后密度樹突棘(PSD)的骨架分子，其中，PSD-95經典角色是谷氨酸受體蛋白穩(wěn)定性的主要支架部分[12]。PSD-95作為重要的支架蛋白在興奮性突觸的PSD大量富集，PSD-95中分特定的PDZ結構域大量介導了細胞內信號傳導分子和細胞表面粘附分子，離子通道和受體包括NMDA受體的相互作用[13,14]。PSD-95在突觸可塑性中被認可具有廣泛功能，包括膜蛋白和蛋白質運輸的定位調節(jié)作用。許多信號傳輸通過它們的胞質域。直接在突觸上與PSD-95互動，形成了豐富的突觸后骨架蛋白，起到了調節(jié)突觸可塑性的功能。突觸定位和NMDA受體的活性是由MAGUK家族蛋白(PSD-95,PSD-93，SAP-102和SAP-97)的成員調制，El-Husseini等[15]研究發(fā)現(xiàn)PSD-95的過度表達可以帶動谷氨酸突觸的成熟,它的表達可以增強谷氨酸受體的突觸聚集和活動,PSD-95突觸后的表現(xiàn)也增強了突觸前終端的成熟，PSD-95的表達也增加樹突棘的數量和大小，這些結果表明PSD-95的可編排突觸發(fā)展，提示了PSD-95在突觸穩(wěn)定和可塑性的重要角色。許多病理過程是用一種或多種突觸后神經遞質受體的故障相關聯(lián)，在PSD-95和NMDA受體的耦合與DA受體彼此間功能及調控功能中發(fā)揮重要作用。有研究顯示在紋狀體神經元破壞D1R和PSD-95的相互作用會降低大鼠和獼猴模型的LID發(fā)展和嚴重程度[16]。突觸蛋白，包括受體被轉運、錨定，并通過PDZ結構域的蛋白質，其中最為明顯的特點是PSD-95聚集。PSD-95的提高可以改變突觸可塑性的可能性，它們可能是造成帕金森病和LID原因[12]。

圖5 Westernblot檢測NR2A(Y1325)水平的變化 與正常組比較,△P=0.033<0.05,與帕金森組比較,*P=0.040<0.05,與異動癥組比較,**P=0.686>0.05,與對照組比較,***P=0.001<0.01,與干預組比較,※P=0.229>0.05

圖6 Westernblot檢測NR2B(Y1472)水平的變化 與正常組比較,△P=0.006<0.01,與帕金森組比較,*P=0.010<0.05,與異動癥組比較,**P=0.666>0.05,與對照組比較,***P=0.001<0.01,與干預組比較,※P=0.071>0.05

PSD-95的S295的磷酸化可以通過慢性活動操作來調節(jié),S295位點的磷酸化水平反映了PSD-95的突觸強度，抑制S295的磷酸化會引起響應于NMDAR處理引起的LTD,S295的磷酸化促進PSD-95和影響增強突觸的積累，而LTP的誘導化學(化學LTP)的刺激增加了S295的磷酸化[17]。PSD-95是突觸強度和可塑性的重要調節(jié)器，PSD-95的過度表達在培養(yǎng)的神經元突觸增加AMPA受體集群和電流[15]。PSD-95的過表達增加了微型興奮性突觸后電流(mEPSCs)的頻率，影響LTD以及LTP和關閉AMPA受體突觸傳遞的驅動[18,19]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，外源性的輸入L-DOPA對6-OHDA制作的PD模型中，mTOR信號通路的激活影響到突觸骨架分子PSD-95的表達，并且產生明顯變化(One-Way ANOVA，P<0.05)，且骨架分子PDS-95與mTOR信號通路的激活成一致性；作為骨架分子的PSD-95發(fā)生變化，PSD-95以D1和NMDA受體三元蛋白復合物的形式，并整合增強兩種受體之間的的相互作用[12]，最新研究表明，抑制PSD-95蛋白表達能夠下調NMDA受體過度活化，從而提供了有利于LID的療法[20]。因此本研究驗證了LID中阻斷mTOR信號通路會導致PSD-95及其磷酸化的水平下降，而兩者都在突觸可塑性具有重要的作用，這可能是mTOR信號調控底物的磷酸化水平改變了PSD-95、S295的變化。這提示了激活mTOR信號通路的途徑可能依賴PSD-95以及S295的突觸活動引起LID，但是兩者之間具體如何相互整合突觸活動尚需進一步研究。

3.2mTOR與突觸可塑性關鍵分子NMDA受體亞基磷酸化水平與LID發(fā)病機制

DR和NMDA受體的功能性相互作用已被廣泛研究。眾多的研究表明，活化D1R或D2R的可調節(jié)NMDA受體的功能和轉運，例如，在紋狀體長時程增強(LTP)的誘導要求D1R的活化，D1R拮抗劑阻斷防止NMDA受體依賴性LTP，而這種效果是通過D1R的激活逆轉[21,22]。NMDAR的NR1亞基由單個基因的8個剪接變異體,NMDAR通過其NR1-C末端區(qū)域NR1-C2和NR1-C2拼接的豐富程度與D1R相互作用。NMDAR聚合物與D1R內化誘導激動劑刺激相互作用，ERK的磷酸化(即激活)被限制于中型棘狀神經元D1R的表達，并取決于D1R和谷氨酸NMDAR的伴隨刺激，然而負責該激活的D1R和NMDAR各自的發(fā)生的機制仍未明確[23]。D1R激動劑可以增加NR2B(Y1472)的磷酸化水平[24]。觸發(fā)NMDA受體的開放或關閉通常要受多種因子的影響，NMDA受體的磷酸化是其調控的最重要的機制之一[25]。

D1R和D2R激動劑-L-DOPA產生的運動障礙和類似的發(fā)病率已經明確并具有嚴重性，而基底節(jié)谷氨酸傳輸信號通路異常已被證明是在PD和LID的發(fā)展的重要參與者[26,27]。激動劑D1R會增加整體NMDA受體NR1亞單位的磷酸化水平[28]。NR2A和NR2B積極的參與了突觸可塑性中的活動，置換NR2B與NR2A導致降低神經元突觸的LTP[29]，與D1R互動進一步增加了NMDAR系統(tǒng)的復雜性。D1R的激活是對谷氨酸(NMDA、AMPA等)誘導的長時程增強的皮質紋狀體突觸的生成至關重要，黑質紋狀體多巴胺能投射到皮質紋狀體接收運動信息的處理是非常重要的，在6-OHDA損毀大鼠中顯著改變了紋狀體的興奮傳導,該途徑會導致類似于一些PD的癥狀等自發(fā)的變化[23]。從紋狀體切片皮質纖維高頻刺激(HFS)產生的LTP中突觸電位會發(fā)生改變，興奮性突觸后電位(EPSP)通過刺激皮質纖維誘發(fā)LTP，可能觀察到一些在PD中所表現(xiàn)的運動障礙[23,30]。谷氨酸(NMDA等)的動力學與D1R信號傳導級聯(lián)密切相關，多巴胺受體激動劑會促進紋狀體中的NMDA亞基NR1(Ser896)的磷酸化表達[31]。多巴胺D1R耦合PKA的活化誘導NMDA受體NR1磷酸化，在中樞神經系統(tǒng)中絲氨酸896位點的磷酸化較為常見[32]。在紋狀體神經元中可通過NR1亞基去磷酸化水平下調谷氨酸的活性[33]。慢性左旋多巴治療6-OHDA所致的PD大鼠模型中會影響NMDA受體各亞基成分的變化，而且NMDAR1磷酸化表達水平升高[34]。Ser896是在NR1亞基上的胞內羧基端磷酸化位點上，該位點的磷酸化能夠調節(jié)NMDA受體的活性和易化突觸傳遞的作用。而NMDA受體的NR2A與NR2B兩個亞基在突觸可塑性中起著關鍵因素。

NMDA受體的活性是通過NR1亞基磷酸化的調制[35]。NMDANR2A亞單位Y1325磷酸化位點是主要的酪氨酸殘基之一[36]，其磷酸化水平被認為是NMDA受體的活性的一個良好指標，是調節(jié)突觸可塑性的關鍵步驟[37]。另外從突觸可塑性作為其關鍵分子，即從NMDANR1(ser896)磷酸化水平反應NMDA受體細胞膜數量、NMDA受體的活性的一個良好指標NMDANR2A(Y1325)以及NMDA受體最重要的NMDANR2B(Y1472)出發(fā)，突觸可塑性的許多分子，至于具體如何以怎么樣的突觸參數等去平衡紋狀體NMDA受體亞基磷酸化水平并降低LID發(fā)生的風險，其尚需要進一步研究。在突觸后膜致密區(qū)(PSD)中NR2B是發(fā)生酪氨酸磷酸化調節(jié)的主要亞單位，其中Tyr1472是最重要的磷酸化靶位點[38,39]。

本研究發(fā)現(xiàn)，LID組的NMDA亞基磷酸化水平NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)的表達水平均為最高，其中在LID組和C組之間兩者比較無明顯差異(P>0.05)，雷帕霉素干預后NMDA亞基磷酸化水平NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)的表達水平明顯下降(P<0.05)。同樣，在實驗大鼠LID的模型中Gardoni等[40]研究發(fā)現(xiàn)在LID的發(fā)展過程中證實突觸NMDA受體通過使用一種細胞滲透性肽的組合物來調制NR2A亞基以致減少的大鼠LID的進程中所占比，也就是說預防含NR2A-NMDA受體的突觸異常激活足以確定具有一個顯著減少LID發(fā)病的作用；靶向離子型谷氨酸受體劑可改善PD的運動癥狀，以及降低LID的運動行為的發(fā)作[41]。NMDA受體過度活化并與LID緊密關聯(lián)，同樣選擇性NR2B亞基拮抗劑可以改善LID[42]。mTOR信號通路在突觸水平的失調有牽連PD的發(fā)病機制，在突觸水平適當的操縱AMPK/AKT/mTOR的信號是預防和治療PD的一個潛在策略[43]。

本實驗中也發(fā)現(xiàn)這一系列的突觸關鍵分子磷酸化水平的變化均與mTOR信號有關，這可能是mTOR信號調控底物的磷酸化水平改變了MDA亞基NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)磷酸化的表達水平，提示了激活mTOR信號通路可能不僅依賴PSD-95同時也依賴于關鍵分子NMDA受體亞基磷酸化一系列的突觸活動引起LID。

因此本研究發(fā)現(xiàn)：1、mTORC1參與了LID的發(fā)病，應用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素能夠緩解異動癥嚴重程度；雷帕霉素并不影響L-DOPA對PD的治療，這與以往的研究相符[44]；2、大鼠紋狀體區(qū)的mTOR信號通路激活與LID的發(fā)生密切，D1R受體過度活化，mTOR信號的激活對紋狀體的突觸分子具有調節(jié)作用，導致突觸可塑性的骨架分子PSD-95以及關鍵分子NMDA亞基的磷酸化表達水平升高，mTOR信號轉導可能依賴突觸分子PSD-95、NMDA受體NR1(ser896)、NR2A(Y1325)、NR2B(Y1472)亞基磷酸化等的表達引起突觸活動過表達，使突觸可塑性發(fā)生適應性改變，最終產生和維持皮質紋狀體突觸“病理性LTP”，出現(xiàn)基底節(jié)信號異常，從而介導了LID的發(fā)生。

圖7 mTOR信號通路被激活管理L-DOPA及參與LID

總之，L-DOPA誘發(fā)運動障礙的突觸機制，是懸而未決的問題[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，從突觸可塑性的一些分子水平表達當中得出mTOR信號通路激活異動癥組中大鼠PSD-95、NMDA受體亞基的磷酸化表達水平升高，經特異性抑制mTOR信號后可以減輕LID癥狀并降低PSD-95、NMDA受體亞基的磷酸化表達水平，mTORC1參與LID的發(fā)病過程，而這過程中PSD-95、NMDA受體功能增強在“病理性LTP”產生中起重要作用，但是“病理性LTP”中的調控涉及到PSD-95、NMDA受體等到底是怎么整合的具體機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

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(2015-11-12收稿2016-04-12修回)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(項目編號為31260241)

【中圖分類號】R

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)03-0182-09