張國輝，仵均祥

(1 西北農林科技大學 植物保護學院 植保資源與病蟲害治理教育部重點實驗室，應用昆蟲學重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2 長江大學 農學院 昆蟲研究所，濕地生態(tài)與農業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025)

梨小食心蟲普通氣味結合蛋白2(GmolGOBP2)cDNA的克隆與原核表達

張國輝1,2，仵均祥1

(1 西北農林科技大學 植物保護學院 植保資源與病蟲害治理教育部重點實驗室，應用昆蟲學重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2 長江大學 農學院 昆蟲研究所，濕地生態(tài)與農業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025)

[摘要]【目的】 克隆梨小食心蟲(Grapholita molesta)普通氣味結合蛋白2 (GmolGOBP2)的全長cDNA序列并進行原核表達, 為研究該蛋白在梨小食心蟲化學感受系統(tǒng)中的作用奠定基礎?！痉椒ā?利用RT-PCR和RACE技術克隆GmolGOBP2的全長cDNA序列，并使用原核表達載體pET-32a在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，用SDS-PAGE和Western blot檢測其表達情況?！窘Y果】 GmolGOBP2的cDNA全長序列為 637 bp(GenBank登錄號：JN857940)，開放性閱讀框長度為483 bp，編碼161個氨基酸殘基，成熟蛋白分子質量為15.98 ku，等電點為4.85。GmolGOBP2預測蛋白的N末端具20個氨基酸殘基組成的信號肽序列，并且氨基酸序列中具有6個保守半胱氨酸的典型氣味結合蛋白家族標志。將GmolGOBP2編碼序列重組到表達載體pET-32a中，轉入大腸桿菌BL21(DE3)進行原核表達，SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示，梨小食心蟲普通氣味結合蛋白基因在大腸桿菌中成功地表達出分子質量約為32 ku的融合蛋白，與預測的融合蛋白分子質量大小一致?！窘Y論】 克隆并原核表達了GmolGOBP2 的cDNA序列，可用于研究該蛋白分子結構及其在化學感受系統(tǒng)中的功能。

[關鍵詞]梨小食心蟲；普通氣味結合蛋白2；分子克隆；原核表達

昆蟲的嗅覺系統(tǒng)與其生存和繁殖息息相關[1]。昆蟲通過嗅覺系統(tǒng)捕獲周圍環(huán)境中的化學信號，如各種氣味信息素，并以此作為尋找配偶、食物、產卵場所以及躲避天敵和其他威脅的信息來源[2]。觸角是昆蟲重要的嗅覺器官，昆蟲觸角上化學感受器淋巴液中的氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)，被認為是傳遞外界氣味信息素并將其通過淋巴液送到嗅覺神經元，進而引發(fā)嗅覺神經沖動的主要蛋白[3]。氣味結合蛋白首次發(fā)現于蛾類昆蟲觸角中[4]，目前已在多種昆蟲中發(fā)現有氣味結合蛋白的存在[5-7]。在鱗翅目昆蟲中氣味結合蛋白分為2類，即信息素結合蛋白(pheromone-binding proteins，PBPs)和普通氣味結合蛋白(general odorant binding proteins，GOBPs)[8-9]。信息素結合蛋白多在雄蟲觸角中特異性表達，與感受性信息素有關，其氨基酸序列在不同昆蟲種間保守性較差[8]。普通氣味結合蛋白分為普通氣味結合蛋白1和普通氣味結合蛋白2兩類[8]，其在昆蟲兩性觸角中表達量基本相同，且氨基酸序列在不同昆蟲種間保守性較高。到目前為止，普通氣味結合蛋白的基因已從不同種昆蟲中克隆出來[9-11]。起初由于普通氣味結合蛋白能夠結合寄主植物產生的氣味分子，而被認為其用以識別寄主揮發(fā)物[12]。但后續(xù)的研究證實，多種異源表達的昆蟲普通氣味結合蛋白不僅能夠結合寄主揮發(fā)物，而且對昆蟲自身性信息素組分也表現出很強的結合能力[13-16]。因此，普通氣味結合蛋白是昆蟲化學通信過程中的重要功能蛋白。

梨小食心蟲是一種嚴重危害桃、梨等多種果樹的世界性重要害蟲，在我國和其他許多國家或地區(qū)猖獗發(fā)生，對果業(yè)生產造成了嚴重危害。目前，生產上主要依靠果實套袋和化學防治，但前者費工、費時，且隨勞動力價格的上漲已面臨嚴峻的挑戰(zhàn)；化學防治則因該蟲鉆蛀危害，隱蔽性強而殺蟲效果較差。鑒于此，研發(fā)經濟高效的梨小食心蟲防治新技術已成為生產中亟待解決的問題。本研究利用RT-PCR和RACE技術克隆GmolGOBP2的全長cDNA序列，并使用原核表達載體pET-32a在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，以期為深入研究梨小食心蟲成蟲嗅覺識別系統(tǒng)中GOBP2的功能以及研發(fā)梨小食心蟲的新型行為調節(jié)劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

梨小食心蟲(Grapholitamolesta)由西北農林科技大學植物保護學院農業(yè)害蟲綜合治理研究室提供。幼蟲期飼喂人工飼料[17]，成蟲期飼喂10%蜂蜜水。飼養(yǎng)條件：溫度(24±0.5) ℃、相對濕度(70±10)%、光周期為15 h(光)/9 h(暗)。

1.2方法

1.2.1梨小食心蟲觸角總RNA的提取及cDNA的合成取梨小食心蟲成蟲觸角50根，用液氮研磨后，按照RNApure Reagent(北京莊盟)說明書提取總RNA，參照PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa) 說明書反轉錄獲得第一鏈cDNA。

1.2.2梨小食心蟲GOBP2 cDNA序列的克隆比較GenBank中已報道的昆蟲GOBP的cDNA序列，設計擴增GOBP2同源片段的簡并引物GOBP-c1和GOBP-c2(表1)。PCR反應條件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根)純化后，連入pGEM-T Easy載體(Promega)，將陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。根據獲得的梨小食心蟲普通氣味結合蛋白2基因片段設計5′和3′ RACE引物GOBP2-3′outer、GOBP2-3′inner和GOBP2-5′outer、GOBP2-5′inner(表1)。按照RACE試劑盒(TaKaRa)說明書擴增5′和3′端的cDNA。然后將5′和3′端的RCR產物割膠回收純化，連入pGEM-T Easy載體，送樣測序，將獲得的片段進行拼接獲得GOBP2的全長cDNA序列。

為了核實5′和3′的擴增片段源自同一基因，設計了1對特異性驗證引物GOBP2-full1和GOBP2-full2(表1)，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，并與拼接的GOBP2全長cDNA序列進行比較。

1.2.3序列分析使用在線工具BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析序列相似性，用在線軟件SingalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測；使用在線軟件Expasy(http://www.expasy.ch/cgi-bin/pi_tool)進行蛋白基本理化特征鑒定。

1.2.4表達載體的構建根據梨小食心蟲GOBP2的ORF序列設計1對去信號肽的特異性引物GOBP2-ex1和 GOBP2-ex2(表1)，為了便于將目的基因亞克隆到表達載體上，在引物中設計了酶切位點(以下劃線表示)，其中在正向引物設計了BamHⅠ酶切位點，反向引物設計了Hind Ⅲ 酶切位點。PCR產物回收純化后連入pGEM-T Easy 載體，藍白斑篩選陽性轉化子，將雙酶切鑒定正確的轉化子送樣測序。將測序正確的重組質粒經BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，回收相應大小的片段。將回收的DNA片段與經同樣雙酶切的表達質粒pET-32a(+)混合，構建重組表達載體pET/GomlGOBP2，然后轉化克隆菌株DH5α，提取質粒經PCR檢測和雙酶切鑒定后測序。測序正確的表達載體用于后續(xù)原核表達。

表 1　研究所用引物及其序列

1.2.5梨小食心蟲GOBP2在原核細胞中的表達將測序正確的表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，選取雙酶切鑒定正確的陽性單克隆于4 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)中培養(yǎng)過夜后，然后按體積分數1% 接種量在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6左右，加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，28 ℃、200 r/min繼續(xù)誘導5 h。收集菌液，12 000 r/min離心5 min，去除上清。加入100 μL 1×SDS凝膠加樣緩沖液后振蕩懸浮菌體，煮沸10 min后電泳分析表達情況。

1.2.6融合蛋白可溶性檢測將誘導后菌液超聲波破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.2.7Western blot檢測首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉移到PVDF膜上，然后用封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)封閉過夜；接著與鼠抗6×His單抗室溫反應1 h，用TBST洗膜5次；加入使用TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，室溫反應1 h， 用TBST洗膜5次；最后將PVDF膜置于顯色液中顯色至條帶清晰，將膜放入蒸餾水中終止顯色，拍照。

2結果與分析

2.1梨小食心蟲GOBP2的克隆與序列分析

以梨小食心蟲觸角cDNA第一鏈為模板，用簡并引物進行PCR擴增，獲得240 bpGOBP2片段。根據得到的基因片段，設計特異性引物，采用RACE 技術獲得梨小食心蟲GOBP2的全長cDNA序列。序列測定結果表明，該序列全長為636 bp，開放性閱讀框長度為483 bp，編碼161個氨基酸殘基(圖1)。該預測蛋白的N末端具20個氨基酸殘基組成的信號肽序列，成熟蛋白預測分子質量為15.98 ku，等電點為4.85。該蛋白具有氣味結合蛋白的典型特征，為酸性小分子蛋白，且氨基酸序列中含有6個保守半胱氨酸殘基(圖1)。為了核實5′和3′端的擴增片段源自于同一基因，設計了1對特異性引物(GOBP2-full1，GOBP2-full2)加以驗證，經瓊脂糖凝膠電泳檢測到1條特異性條帶(圖2)，測序發(fā)現其與拼接序列一致，從而證實5′和3′擴增片段源自同一基因。

圖 1梨小食心蟲GOBP2 cDNA及其推導的氨基酸序列

“*”表示終止子；下劃線表示蛋白的信號肽序列；方框為6個保守的半胱氨酸

Fig.1cDNA sequence and deduced amino acid sequence of GmolGOBP2

The stop codon is shown with “*”；Signal peptide of GmolGOBP2 is underlined；Conservative Cys sites are indicated by boxes

圖 2　梨小食心蟲GOBP2的PCR擴增

2.2梨小食心蟲GOBP2在大腸桿菌中的表達

將構建成功的GmolGOBP2與硫氧還原蛋白(thioredoxin,Trx)及六聚組氨酸(6×His)的融合表達載體pET/GomlGOBP2轉化工程菌BL21(ED3)，經IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳分析顯示，產生了1條32 ku左右的特異性蛋白條帶，IPTG誘導的含表達載體pET-32a(+)的BL21菌株在相應位置無條帶產生，而是產生了22 ku左右的條帶(圖3)。

圖 3　pET/GmolGOBP2表達產物的SDS-PAGE

融合蛋白可溶性的SDS-PAGE電泳檢測表明，目的蛋白主要在包涵體中表達(圖4)。以鼠抗6×His單抗為一抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠為二抗進行Western blot分析，結果表明，經IPTG誘導產生的32 ku的蛋白條帶與6×His抗體發(fā)生很強的交叉反應，表明融合蛋白得到表達(圖4)。

圖 4　pET/GmolGOBP2融合蛋白的可溶性檢測(A)及

3討論

本研究克隆了編碼梨小食心蟲普通氣味結合蛋白2的cDNA全長序列，即GmolGOBP2，其所推測的成熟蛋白氨基酸序列具備昆蟲氣味結合蛋白家族的典型標志：(1)具有酸性等電點的小分子量水溶性蛋白；(2)具有信號肽的分泌蛋白；(3)氨基酸序列中均含有6個保守半胱氨酸殘基[18]。梨小食心蟲普通氣味結合蛋白基因的克隆為鱗翅目昆蟲氣味結合蛋白家族增添了新的成員，這為后續(xù)研究該目昆蟲氣味結合蛋白的進化關系及結構功能提供了新的參考依據。

梨小食心蟲普通氣味結合蛋白2所推導的氨基酸序列，可以為闡釋該蛋白的生理功能提供一定的理論依據，但僅僅依靠對其氨基酸序列的分析，顯然無法揭示其功能。在生物工程各項技術中，基因異源表達技術是用來分析基因功能的一項基礎研究。因此，要了解梨小食心蟲普通氣味結合蛋白和化學感受蛋白基因的生理功能，就有必要對其進行異源表達。

昆蟲能感受環(huán)境中的氣味信息素，并依此作為尋偶、覓食及定位產卵場所的信息來源[2]。而昆蟲感器中的氣味結合蛋白與脂溶性的氣味物質結合，是昆蟲專一性識別外界氣味信息物質的第一步生化反應[19]，對于昆蟲與外界進行信息交流具有重要意義。因此氣味結合蛋白的研究已在多目昆蟲中廣泛開展，如鱗翅目[20]、雙翅目[5]、直翅目[6]、鞘翅目[21]、等翅目[7]、膜翅目[22]和半翅目[23]等。本研究克隆了梨小食心蟲GmolGOBP2，并將GmolGOBP2與硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)融合，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了帶有6×His純化標簽的蛋白。Trx的存在提高了GmolGOBP2的表達量和可溶性，這為GmolGOBP2的大量表達以及研究該基因編碼蛋白的空間結構和生理功能奠定了良好的基礎。

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Cloning and prokaryotic expression of general odorant binding protein 2 cDNA from oriental fruit moth,Grapholitamolesta

ZHANG Guo-hui1,2,WU Jun-xiang1

(1KeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagement,MinistryofEducation,KeyLaboratoryofAppliedEntomology,andCollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China；2EngineeringResearchCenterofEcologyandAgricultrualUseofWetland,MinistryofEducation,InstituteofEntomology,AgriculturalCollege,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei434025,China)

Abstract:【Objective】 Cloning and prokaryotic expression of a novel cDNA encoding the general odorant binding protein 2 (GOBP2) from the oriental fruit moth Grapholita molesta was conducted.【Method】 The full-length cDNA encoding GOBP2 isolated from Grapholita molesta by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends-PCR (RACE-PCR) was named as GmolGOBP2.It was then constructed into the expression vector pET-32a and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3).【Result】 The full length cDNA of GmolGOBP2 was 637 bp (GenBank accession no.JN857940),containing a 483 bp open reading frame with 161 amino acids.The deduced molecular weight (MW) was 15.98 ku and the PI was 4.85.Protein signature analysis indicated that the deduced GmolGOBP2 contained an N-terminal signal sequence of 20 amino acids.The GmolGOBP2 was then constructed into the expression vector pET-32a and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) after induction with IPTG.SDS-PAGE and Western blot analysis showed the molecular weight of the recombinant GmolGOBP2 was about 32 ku,in consistence with the predicted result.【Conclusion】 GmolGOBP2 was cloned and expressed in prokaryotic expression system,which was helpful for further studies on its molecular structure and function in the olfactory system.

Key words:Grapholita molesta;general odorant binding protein 2;molecular cloning;prokaryotic expression

DOI：網絡出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.016

[收稿日期]2014-11-07

[基金項目]國家自然科學基金項目(31501641，31272043)；農業(yè)部公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201103024)

[作者簡介]張國輝(1983-)，男，河北邯鄲人，講師，博士，主要從事昆蟲生態(tài)與害蟲綜合治理研究。

[通信作者]仵均祥(1961-)，男，陜西鳳翔人，教授，博士生導師，主要從事農業(yè)昆蟲與害蟲防治及植物檢疫研究。

[中圖分類號]S433.4；Q966

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0111-05

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.032.html

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