李景艷，高　飛，周宜君，王　榮

(1 安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601；2 阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；3 中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

鹽芥GRP7基因的克隆和逆境表達分析

李景艷1，2，高飛3，周宜君3，王榮2

(1 安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601；2 阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；3 中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

[摘要]【目的】 從抗逆植物鹽芥中分離GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7，GRP7)基因，為進一步揭示GRPs基因在鹽芥逆境應答中的作用機制及生物學功能奠定基礎?！痉椒ā?利用鹽芥GRP7基因的EST序列設計特異引物，克隆GRP7基因的全長序列，對其保守結構域和系統(tǒng)進化樹進行分析，并對TsGRP7基因的啟動子區(qū)進行預測；利用qRT-PCR技術，檢測GRP7基因在不同逆境脅迫、不同組織中的表達情況?！窘Y果】 TsGRP7基因編碼區(qū)全長522 bp，編碼173個氨基酸；TsGRP7蛋白的N端第9～82位氨基酸之間有1個RNA識別基序(RRM)，RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亞結構域；多重序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，鹽芥和擬南芥親緣關系較近；啟動子序列分析表明，鹽芥GRP7啟動子區(qū)含有HSE熱激響應元件、LTR低溫應答元件等多個逆境相關的順式作用元件，表明鹽芥GRP7基因參與逆境響應。qRT-PCR分析表明，鹽芥GRP7基因在不同逆境脅迫條件及不同組織中表達不同?！窘Y論】 鹽芥GRP7基因參與低溫、高鹽、PEG等逆境響應。

[關鍵詞]鹽芥；GRP7；qRT-PCR；逆境脅迫

真核生物中，基因的表達在轉錄和翻譯水平上均受到嚴格的調控?；虮磉_調控的第一步，即轉錄調控曾被認為是基因表達調控的主要環(huán)節(jié)，通過對基因表達調控機制越來越深入的了解，現(xiàn)在逐漸認識到轉錄后和翻譯水平上的調控對基因表達同樣起著重要的作用。有研究表明，轉錄后和翻譯后的調控對真核生物適應生物及非生物脅迫有一定的幫助[1]，這個過程主要通過不同的RNA結合蛋白來進行，尤其在調控涉及RNA的以下幾個過程，如mRNA的轉運、mRNA穩(wěn)定性的維持、mRNA的翻譯控制等[1-5]。典型的RNA結合蛋白(RBPs)含有1個或2個RNA識別基序(RNA-recognition motif)，主要位于其N-末端和各種輔助基序或區(qū)域的C-末端，例如富含谷氨酸的區(qū)域、富含精氨酸的基序、RGG box、鋅指結構基序及SR或RD重復區(qū)域等[6]。最新研究表明，RBPs在不同的植物基因組序列中被發(fā)現(xiàn)，包括擬南芥、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、煙草、油菜和亞麻[6]，這表明RBPs參與植物的生長發(fā)育、抗逆性等代謝過程[3,7-8]。

現(xiàn)已在許多植物中鑒定出富含甘氨酸的RNA結合蛋白(GRPs)，其N端含有1個或多個RNA識別基序(RRM)，在C端有1個富含甘氨酸的區(qū)域[9-10]。盡管對GRPs的功能研究還不是特別深入，但已有研究表明，GRPs的表達受一系列的外部刺激調控，包括寒冷、水分、植物激素脅迫、損傷、病毒感染等[10]。

近年來，一種新的抗非生物逆境研究模式植物，即鹽芥(Thellungiellasalsugineum)越來越受到人們的關注。鹽芥是擬南芥的近緣植物，表達序列標簽(EST)分析表明，鹽芥和擬南芥cDNA和氨基酸序列的同源性高達90%～95%[11]，鹽芥在植物抗非生物逆境方面有廣闊的應用前景，能耐受較高程度的高鹽、低溫和干旱脅迫[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥8個GRP家族中的AtGRP2和AtGRP7[13]在寒冷脅迫中起作用[14-16]，推測鹽芥中的TsGRP7基因可能也參與逆境響應。本研究擬從鹽芥中克隆GRP7基因，用生物信息學方法分析其結構特征進而推測其蛋白序列特征，對其8種同源蛋白進行多重序列比對并構建系統(tǒng)進化樹，利用qRT-PCR分析TsGRP7基因在高鹽、低溫、干旱條件下的基因表達模式，以期為GRPs的功能研究提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

Trizol試劑，購于invitrogen公司；反轉錄試劑盒、Taq酶及qRT-PCR試劑盒，均購于天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒，購自百泰克生物技術有限公司；T4DNA連接酶及pGEM?-T載體，購自Promega公司。引物合成及片段測序由華大科技有限公司完成。

1.2試驗材料的處理

鹽芥種子播種在培養(yǎng)基質為營養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖 (質量比質量比為2∶1∶1)的混合土中，每3 d澆1次水。生長條件為：溫度23 ℃(光)/18 ℃(暗)，光照周期16 h(光)/8 h(暗)，相對濕度60%(光)/80%(暗)。待其生長4周后移栽至新的培養(yǎng)基質中(m(蛭石)∶m(珍珠巖)=1∶1)，期間每3 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液。待其生長至6周后，取少量葉片迅速凍于液氮中，用于基因克隆。用Hoagland營養(yǎng)液配制300 mmol/L NaCl溶液和質量分數(shù)20%PEG6000溶液，然后將鹽芥在配制好的NaCl溶液、PEG6000溶液及4 ℃低溫條件下分別處理0，1，3，6和24 h，分別模擬高鹽、干旱和低溫脅迫處理，同時以正常培養(yǎng)鹽芥為對照，之后取各處理鹽芥的適當葉片和根迅速凍于液氮中，用于基因的組織特異性表達分析。

1.3TsGRP7基因的克隆

用Trizol法提取鹽芥的總RNA，并用1%瓊脂糖電泳檢測其完整性，用NanoDrop 2000測定DNA濃度和OD260/280。以RNA為模板，根據(jù)天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作得到cDNA后，低溫保存用于后續(xù)試驗。

利用擬南芥AtGRP7序列(序列注冊號為AT4G13850)進行Blast分析，找到與AtGRP7序列同源性最高的鹽芥GRP7的EST序列，根據(jù)TsGRP7的CDS序列，用Primer3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)在線設計基因克隆引物，所得引物序列見表1。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反應體系50 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，2×TaqPCR MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后進行膠回收，回收產(chǎn)物與pGEM?-T載體在T4DNA連接酶作用下4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選得到陽性克隆，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，將得到的單一條帶所對應的菌落挑出送華大科技有限公司測序。

表 1　TsGRP7基因克隆和熒光定量PCR相關的引物序列

1.4生物信息學分析

運用生物信息學軟件DNAMAN7.0查找TsGRP7基因全長序列的開放閱讀框(ORF)，翻譯成氨基酸序列并分析等電點、氨基酸數(shù)目、相對分子質量等理化性質。利用在線工具NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)分析其氨基酸序列潛在的磷酸化位點；用在線工具TMHMM2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質跨膜區(qū)結構；用在線工具SignaIP3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析其信號肽；用在線工具WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)進行亞細胞定位；用在線程序SMART進行保守結構域分析；利用NCBI的BlastP功能獲得與TsGRP7氨基酸序列同源性較高的其他植物的氨基酸序列，用DNAMAN和MEGA5.0軟件進行蛋白多序列比對并構建系統(tǒng)進化樹。

用Phytozome網(wǎng)站和TsGRP7 CDS序列找到TsGRP7基因的啟動子序列，運用在線工具PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TsGRP7基因編碼序列上游1 000 bp啟動子區(qū)域內存在的順式作用元件。

1.5表達模式分析

從低溫、高鹽、PEG6000脅迫處理的鹽芥中提取RNA，電泳檢測其完整性，根據(jù)天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明轉錄成cDNA，用NanoDrop 2000測定cDNA濃度，稀釋成統(tǒng)一濃度后用于熒光定量PCR。利用在線工具Primer 3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)設計熒光定量PCR引物，并以鹽芥的Ubiquitin10基因為內參基因，所用引物序列如表1所示。按照天根FastFire qPCR PreMix試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR，用2-ΔΔCt法對熒光定量PCR的結果進行計算和統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.1TsGRP7基因的克隆

Trizol法提取鹽芥的總RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測其完整性，結果得到28S、18S、5S共3條清晰條帶，且28S條帶亮度約是18S的2倍。用NanoDrop 2000檢測提取的RNA濃度，OD260/280為 2.10，說明提取的RNA完整性較好、純度較高，可用于后續(xù)試驗。

以反轉錄獲得的cDNA為模板，使用克隆引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果(圖1)表明，PCR產(chǎn)物為單一、明亮的條帶，大小為500～600 bp。PCR產(chǎn)物膠回收后，與T載體連接轉化大腸桿菌DH5α細胞。取5個陽性菌落培養(yǎng)后測序，測序得到的序列與TsGRP7 EST序列中的相應區(qū)域完全相同，確認該片段為鹽芥TsGRP7基因序列。

2.2TsGRP7基因的序列分析

TsGRP7基因編碼區(qū)全長522 bp，編碼173個氨基酸(圖2)，其中19個為酸性氨基酸，18個為堿性氨基酸。DNAMAN7.0軟件分析表明，預測的蛋白分子質量為16.62 ku，等電點為5.54。

NetPhos 2.0 Server分析表明，TsGRP7蛋白有13個潛在的磷酸化位點，包括8個Ser、3個Thr和2個Tyr位點；TMHMM 2.0 Server在線預測表明，該蛋白不存在跨膜結構，不是跨膜蛋白；在線工具SignaIP3.0 Server分析表明，TsGRP7蛋白無信號肽，不是分泌蛋白；使用WoLF PSORT進行亞細胞定位分析，預測該蛋白定位于細胞核中；用在線工具SMART對其保守結構域的分析表明，TsGRP7蛋白的N端第9～82位氨基酸之間有1個RNA識別基序(RRM)；由氨基酸序列可知，其C端有富含甘氨酸的區(qū)域。RRM中含有保守的RNP-1 (GFGFVTF，50～56位氨基酸)和RNP-2(CFVGGL， 10～15位氨基酸)亞結構域，在C端有1個arginine-glycine-rich (RGG)位點，這是核定位GRP蛋白的特征位點。以上分析結果表明，TsGRP7蛋白是一個典型的富含甘氨酸的RNA結合蛋白。

圖 1　鹽芥TsGRP7基因PCR產(chǎn)物的電泳檢測

圖 2　TsGRP7基因的ORF序列及編碼的氨基酸序列

2.3TsGRP7氨基酸序列同源性及進化樹分析

將TsGRP7氨基酸序列在NCBI中進行BlastP比對，找到其在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicacampestris)、毛果楊(Populustrichocarpa)、高山離子芥(Chorisporabungeana)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中的同源蛋白。對這9種蛋白的氨基酸序列進行比對，結果如圖3所示。再進一步構建TsGRP7蛋白和其他8種同源蛋白的系統(tǒng)進化樹見圖4。結果表明，鹽芥的GRP7蛋白與油菜中同源蛋白的同源性最高，其次是高山離子芥、擬南芥，與水稻中同源蛋白的同源性最低，說明鹽芥與蕓苔屬、擬南芥屬親緣關系較近。

圖 3　TsGRP7與其他8同源性蛋白氨基酸序列的多重比較

圖 4　TsGRP7與其他8種同源性蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

2.4TsGRP7基因啟動子序列分析

順式作用元件(cis-acting element)是啟動子區(qū)域中序列特異性轉錄因子的結合位點，通過與轉錄因子結合調控基因轉錄的精確起始和轉錄效率，從而在基因表達調控過程中起著重要的作用。使用plantCARE軟件預測TsGRP7基因啟動子區(qū)的順式作用元件的種類和作用，有助于揭示TsGRP7基因的表達調控機制。分析結果(表2)表明，TsGRP7基因啟動子區(qū)含有多種與植物非生物脅迫、生物脅迫和激素應答有關的順式作用元件，表明TsGRP7參與了鹽芥的非生物脅迫和生物脅迫應答。

2.5TsGRP7的逆境表達模式分析

為進一步揭示TsGRP7應答逆境的表達模式，以鹽芥Ubiquitin10為內參基因，利用qRT-PCR方法分析高鹽、干旱、低溫逆境條件下TsGRP7基因在鹽芥根和葉中的表達情況，結果如圖5所示。

表 2　TsGRP7基因啟動子區(qū)中可能參與逆境脅迫的順式作用元件

圖 53種逆境脅迫下鹽芥葉和根中TsGRP7基因的表達分析

A.20% PEG6000模擬干旱處理；B.300 mmol/L NaCl處理；C.4 ℃低溫處理

Fig.5Expression patterns ofTsGRP7 in response to three stresses

A.20% PEG treatment;B.300 mmol/L NaCl treatment;C.4 ℃ cold treatment

從圖5-A可知，在20%PEG6000模擬干旱處理鹽芥的24 h中，鹽芥葉片中的TsGRP7表達量總體呈下調趨勢，干旱處理6 h時表達量最低，為對照的0.06倍；24 h時表達量有所提高，為對照的0.86倍。鹽芥根中的TsGRP7表達量整體表現(xiàn)為下調趨勢，與葉中不同，干旱處理1，3 h時的TsGRP7表達量分別為對照的1.24，2.02倍，6 h時下調為對照的0.26倍，24 h時為對照的0.74倍。

圖5-B顯示，在300 mmol/L NaCl處理鹽芥過程中，鹽芥葉中的TsGRP7表達量下調，高鹽處理24 h時表達量達到最低，為對照的0.23倍；與葉相反，鹽芥根中的TsGRP7表達量上調，高鹽處理1 h時表達量最高，為對照的8.5倍，24 h時仍為對照的3.67倍。

圖5-C表明，在4 ℃低溫脅迫處理過程中，鹽芥葉中的TsGRP7表達量于處理3 h時達到最高水平，為對照的2.45倍，處理24 h時表達量又有所下降，但仍為對照的2.14倍；鹽芥根中的TsGRP7表達量上調，6 h時表達量達到最高，為對照的16.86倍。上述結果表明，在不同逆境脅迫下TsGRP7的表達趨勢不同，而在同一脅迫條件下，不同組織中TsGRP7的表達趨勢也不相同。

3討論

植物中存在兩大類GRP蛋白：一類在N端具有典型的真核生物信號肽序列，信號肽序列引導合成的蛋白質進入內質網(wǎng)并最終經(jīng)細胞分泌系統(tǒng)定位于質膜外的細胞壁中；另一類在N端含有90～100個氨基酸組成的RNA結合功能域保守序列(RRM)，其中包括2個保守結構域RNP-1和RNP-2，它們定位于細胞核中，可與新生mRNA前體分子結合，參與形成異源核糖核蛋白復合體[17]。本研究從鹽芥中克隆了富含甘氨酸的RNA結合蛋白(TsGRP7)，運用生物信息學軟件對其氨基酸序列特征進行了分析，結果表明：TsGRP7蛋白無信號肽，不是分泌蛋白；TsGRP7蛋白N端有1個典型的RNA識別基序(RRM)，RRM中含有保守的RNP-1(GFGFVTF，50～56位氨基酸)和RNP-2(CFVGGL，10～15位氨基酸)亞結構域，在C-端有arginine-glycine-rich (RGG)位點，這是核定位GRP蛋白的特征位點。缺失分析表明，RNP-1、RNP-2和富含甘氨酸結構域的氨基酸殘基是RNA結合活性所必需的[17]。許多逆境因子，包括冷害、致傷、干旱、脫落酸(ABA)處理等均能有效誘導GRPs基因家族的RNA表達水平顯著提高[14,18]。鹽芥與擬南芥近緣，鹽芥具有很強的抗低溫、抗干旱和耐鹽的能力。本研究通過鹽芥TsGRP7和其他8種同源蛋白進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)鹽芥GRP7與擬南芥同源蛋白的一致性高達94%；系統(tǒng)進化樹分析也表明，鹽芥與擬南芥有較近的親緣關系。

有研究表明，AtGRP7影響擬南芥的生長及其在高鹽、干旱、低溫下的耐受性，尤其于低溫時通過調控mRNA在細胞中的輸出增加擬南芥的耐受性[19]。GRP7的表達受到不同脅迫因素的調節(jié)，低溫脅迫會顯著提高GRP7的表達水平[14,20]，而高鹽和干旱脅迫則會下調擬南芥中GRP7的表達[21]。本研究用生物信息學方法對TsGRP7基因啟動子序列進行預測，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)含有多個響應逆境脅迫的順式作用元件，說明這些順式作用元件可能與相應的轉錄因子結合進而調節(jié)非生物脅迫下鹽芥TsGRP7基因的表達。RT-PCR分析結果表明，在24 h 20% PEG6000模擬干旱處理鹽芥的過程中，其葉和根中的TsGRP7表達量下調；在300 mmol/L NaCl處理鹽芥的24 h中，其葉中的TsGRP7表達量下調，而根中的TsGRP7表達量上調，說明鹽芥根和葉對逆境脅迫的耐受程度不同；在24 h 4 ℃低溫脅迫鹽芥的過程中，其葉和根中的TsGRP7表達量均上調。TsGRP7基因的表達也受到不同脅迫因素的調節(jié)，TsGRP7基因啟動子預測得到的順式作用元件在基因表達調控過程中起著重要作用，尤其是在逆境脅迫中。

有研究表明，大腸桿菌在受到低溫脅迫時其GRP7蛋白發(fā)揮著RNA分子伴侶的作用[21]。對擬南芥GRP7蛋白細胞定位和功能的研究表明，在高鹽、干旱脅迫下，擬南芥GRP7蛋白表達會抑制種子的萌發(fā)、幼苗的生長并增強植物的逆境耐受性，尤其可通過調節(jié)mRNA在保衛(wèi)細胞的輸送，以增強擬南芥的低溫耐受能力[19]。對高山離子芥低溫條件下基因轉錄水平和蛋白質組的研究表明，CbGRP在低溫條件下表達量上調[10]。CbGRP是RNA的分子伴侶，在基因轉錄后調節(jié)中發(fā)揮作用。更有蛋白質組學研究表明，TsGRP7蛋白通過在低溫脅迫下表達量上調來增強RNA的代謝，進而賦予鹽芥低溫耐受能力[22]。本研究對TsGRP7表達模式的分析表明，鹽芥TsGRP7基因在4 ℃低溫條件下表達量上調，推測TsGRP7蛋白可能通過參與mRNA從細胞核到細胞質的輸送，來增強鹽芥的低溫耐受性。

總之，本研究為進一步了解鹽芥GRP7基因參與高鹽、干旱、低溫等逆境反應的分子機制奠定了基礎，并且本研究從鹽芥中克隆了GRP7基因，為下一步構建表達載體及進行轉基因試驗的驗證提供了條件。

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Cloning and stress expression ofGRP7 inThellungiellasalsugineum

LI Jing-yan1,2,GAO Fei3,ZHOU Yi-jun3,WANG Rong2

(1SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,Hefei,Anhui230601,China;2CollegeofLifeScience,FuyangNormalCollege,Fuyang,Anhui236037,China;3CollegeofLifeandEnvironmentalScience,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Abstract:【Objective】 The glycine-rich RNA-binding protein7 (GRP7) gene was isolated from Thellungiella salsugineum to understand the role of GRPs and lay the foundation for further function analysis of GRPs in stress response.【Method】 In this experiment,specific primers of TsGRP7 were designed based on EST sequence and full-length cDNA of TsGRP7 gene was isolated.The conserved domain and potential cis-element in promoter region were analyzed and phylogenetic analysis was performed.Quantitative real-time PCR analysis was carried out under different stresses in different tissues.【Result】 The 522 bp coding region of TsGRP7 encoded 173 amino acid residues.The region between residues 9 and 82 was a typical RNA-recognition motif,containing conserved RNP-1 and RNP-2 subdomains.Multiple sequence alignment and system evolution analysis of TsGRP7 protein reveled that Thellungiella salsugineum had higher identity with homologous protein in Arabidopsis.Promoter sequence analysis by PlantCARE showed that multiple cis-elements were associated with abiotic and biotic stress localized in promoters,such as HSE,LTR,ABRE,Box-W1 and P-box,indicating that the TsGRP7 gene involved in stree response.Quantitative real-time PCR analysis revealed that the expression of TsGRP7 gene was specific under different stresses and in different tissues.【Conclusion】 The TsGRP7 gene involved in responses to low temperature,high salt and drought stress.

Key words:Thellungiella salsugineum;GRP7;qRT-PCR;stress

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.021

[收稿日期]2015-12-25

[基金項目]國家自然科學基金項目(31070361)；安徽省自然科學基金項目(1408085MC44)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(1112KYQN31，0910KYZY43)；國家985工程項目(MUC98507-08)；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃項目(B08044)；國家民委科研項目(10ZY01)

[作者簡介]李景艷(1988―)，女，河南項城人，在讀碩士，主要從事生化與分子生物學研究。E-mail：602419592@qq.com E-mail：wangrbnu@aliyun.com

[通信作者]王榮(1968―)，女，河北石家莊人，教授，碩士，碩士生導師，主要從事植物分子遺傳學研究。

[中圖分類號]Q945.78；Q943.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0150-07

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.042.html