李　娜，但漢龍，劉　云，羅旭璐，賀　鵬，闞　歡,趙　平

(西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室,云南 昆明 650224)

雀嘴茶中咖啡酰熊果苷提取工藝的響應面法優(yōu)化

李娜，但漢龍，劉云，羅旭璐，賀鵬，闞歡,趙平

(西南林業(yè)大學 西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室,云南 昆明 650224)

[摘要]【目的】 確定雀嘴茶中6′-O-咖啡酰熊果苷(CA)超聲輔助提取的最佳工藝?！痉椒ā?采用超聲輔助法提取雀嘴茶中的CA，通過單因素試驗考察甲醇體積分數(shù)(50%，60%，70%，80%，90%)、液(mL)料(g)比(8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1)、超聲時間(10，15，20，25，30 min)、提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對CA提取率的影響，并利用響應面法優(yōu)化CA的超聲輔助提取工藝?！窘Y(jié)果】 超聲輔助法提取CA的理論最佳工藝條件為：甲醇體積分數(shù)72.87%、液料比 15.87∶1、超聲時間18.96 min、提取次數(shù)3.63次，CA提取率的理論預測值可達到23.12%。根據(jù)實際操作的需要，將提取工藝條件修正為甲醇體積分數(shù)73%、液料比16∶1、超聲時間19 min、提取次數(shù)4次，在此條件下CA實際提取率為23.03%，與理論值較為接近?！窘Y(jié)論】 采用響應面法優(yōu)化雀嘴茶中CA超聲輔助提取的最佳工藝完全可行。

[關鍵詞]雀嘴茶；6′-O-咖啡酰熊果苷；超聲輔助提取；響應面法

雀嘴茶由杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物樟葉越桔(V.dunalianum)的頂芽或嫩葉經(jīng)一系列傳統(tǒng)工藝加工而成，因呈錐狀形似雀嘴而得名[1-2]，為云南省滇中地區(qū)特有的綠色茶品。雀嘴茶中氨基酸種類齊全，含有豐富的礦質(zhì)元素和營養(yǎng)素[3]，其湯色橙黃明亮，香氣馥郁，醇厚回甘，具有祛風除濕、舒筋活絡等功效，自古作為彝族民間保健茶在滇中地區(qū)廣泛飲用至今。尹繼庭等[4-5]對雀嘴茶原料樟葉越桔新鮮葉芽進行了香氣成分的GC-MS分析和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析。Zhao等[6]首次發(fā)現(xiàn)雀嘴茶是一種富含咖啡酰熊果苷類物質(zhì)的特殊植物資源，并從中分離鑒定了29個化合物，其中6′-O-咖啡酰熊果苷(6′-O-caffeoylarbutin,CA)的得率高達22%，這為大量生產(chǎn)天然活性熊果苷類衍生物提供了可能。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)，CA對黑色素的抑制活性和安全性均優(yōu)于熊果苷，其活性為熊果苷的2倍，細胞毒性僅為熊果苷的1/2。而熊果苷是國際公認的21世紀理想的皮膚美白祛斑活性劑[8-10]，但通常以微量形式存在于越桔等屬植物中，且天然植物來源困難。因此，可將雀嘴茶作為熊果苷天然替代品資源加以利用，而開展其中CA的高效提取工藝研究顯得十分必要。

超聲輔助提取法作為一種高效節(jié)能的新興技術，近年來被廣泛應用于植物化學等相關領域[11-14]。在提取工藝條件優(yōu)化上，與傳統(tǒng)的正交試驗法相比，響應面分析法(Response surface methodology,RSM)目前已成為一種通用而有效的設計分析方法，常用于確定各因素及其交互作用在提取過程中對目標響應值的影響，以達到優(yōu)化工藝的目的[15-19]。本研究擬采用超聲輔助法提取雀嘴茶中的CA，在單因素試驗基礎上選取甲醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間和提取次數(shù)4個因素進行中心組合設計，利用響應面法優(yōu)化CA的超聲輔助提取工藝，以期為CA的大量生產(chǎn)及其高附加值產(chǎn)品的研發(fā)等提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

雀嘴茶干燥成品于2014-04購于云南省武定縣，經(jīng)粉碎過0.63 mm(40目)篩后備用。CA對照品為西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室從雀嘴茶中分離所得，經(jīng)HPLC分析其純度達98%，并通過MS、1H和13C NMR波譜解析鑒定其結(jié)構為6′-O-咖啡酰熊果苷[6]。甲醇、乙醇、醋酸均為分析純，水為重蒸餾水。

1.2儀器與設備

Agilent 1200 series高效液相色譜儀，美國Agilent技術公司；LU10AT型超聲波清洗器，西班牙FUNGILAB公司；200 g裝高速中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；CP224C電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1CA的提取工藝流程雀嘴茶→粉碎→加入提取液→超聲輔助提取→過濾→稀釋、定容→測定含量→計算提取率。

1.3.2CA提取率的測定(1)高效液相色譜條件。色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相A：水(含1% HAc)；流動相B：甲醇；洗脫條件：0～5.0 min(5% B)，5.0～5.1 min(5%～15% B)，5.1～25.0 min(15%～65% B)，25.0～25.1 min(65%～95% B)，25.1～35.0 min(95%～5% B)；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：5 μL。

(2)標準曲線的繪制。精密配制質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL的CA對照品溶液，利用高效液相色譜儀分別取1，2，4，8，16和35 μL進樣進行峰面積測定，以峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標進行線性回歸，得到進樣量(x)對峰面積(y)的回歸方程為：y=457.18x-77.597 (R2=0.999 7)。

(3)CA含量測定及其提取率計算。取不同條件下超聲提取后稀釋定容的樣品溶液各5 μL，按照標準曲線測定的方法進行操作，將測定所得的CA峰面積帶入上述回歸方程，結(jié)合稀釋倍數(shù)求得樣品溶液中的CA質(zhì)量(g)，按下式計算樣品在不同提取條件下的CA提取率：

CA提取率=[CA質(zhì)量(g)/雀嘴茶質(zhì)量(g)]× 100%。

1.3.3提取溶劑的篩選精密稱取雀嘴茶粉末 1.000 g，按液(mL)料(g)比14∶1分別加入水或體積分數(shù)20%，40%，60%，80%，100%的甲醇(乙醇)，超聲提取3次，每次 30 min，過濾、定容于100 mL容量瓶中，按1.3.2所示方法測定CA含量并計算其提取率，以確定最適提取溶劑。

1.3.4單因素試驗精密稱取雀嘴茶粉末1.000 g，以甲醇為溶劑，利用超聲輔助提取法，在超聲波功率120 W、甲醇體積分數(shù)80%、液料比14∶1、超聲時間30 min、提取次數(shù)2次的條件下，固定其中4個因素，分別考察不同甲醇體積分數(shù)(50%，60%，70%，80%，90%)、液料比(8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1)、超聲時間(10，15，20，25，30 min)、提取次數(shù)(1，2，3，4，5)對CA提取率的影響，每組試驗重復3次，以確定各因素的適宜范圍。

1.3.5響應面法試驗在單因素結(jié)果基礎上，利用Design-Expert V8.0.6軟件，根據(jù)中心組合試驗設計原理，以CA提取率為響應值，以甲醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)、超聲時間(C)和提取次數(shù)(D)4因素為自變量，每個因素取3個水平以-1，0，1編碼，進行四因素三水平中心組合試驗設計，試驗方案如表1所示。共設30個試驗點，各個試驗點以隨機順序進行，重復3次，取其平均值作為最終結(jié)果，并使用Design-Expert V8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學模型，從而得到最佳的提取工藝條件。

表 1　雀嘴茶中CA提取的中心組合試驗因素水平表

1.3.6驗證試驗根據(jù)試驗操作的實際需要，對1.3.5響應面分析試驗所得的最佳理論提取工藝條件進行適當修正后，準確稱取雀嘴茶粉末1.000 g進行驗證試驗，試驗重復3次，將所得實際提取率與回歸方程所得的理論預測值進行比較，以驗證響應面法所得試驗參數(shù)的準確可靠性。

2結(jié)果與分析

2.1雀嘴茶中CA提取溶劑的選擇

不同體積分數(shù)的甲醇和乙醇對CA提取率的影響見圖1。

圖 1　不同提取溶劑對雀嘴茶CA提取率的影響

由圖1可知，除甲醇體積分數(shù)低于45%時其提取效果低于乙醇外，高體積分數(shù)甲醇的提取效果整體明顯優(yōu)于乙醇。以水為溶劑，超聲輔助提取CA的得率僅為11.9%，提取效果遠低于甲醇和乙醇。為此，本試驗選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2雀嘴茶中CA提取工藝的單因素試驗分析

由圖2-a可知，當甲醇體積分數(shù)在50%～80%時，雀嘴茶中CA的提取率隨甲醇體積分數(shù)的提高而顯著增大；當體積分數(shù)為80%時，CA提取率達到最高；當體積分數(shù)大于80%后，CA提取率趨于下降，這可能是由于較多溶出的脂溶性雜質(zhì)、色素等成分與CA競爭甲醇-水分子，進而導致CA提取率下降[20]。因此，甲醇體積分數(shù)確定為80%。

由圖2-b可知，液料比為10∶1～14∶1時，雀嘴茶中CA的提取率隨液料比的增加而上升；當液料比為14∶1時，CA提取率達到最高；當液料比大于14∶1后，CA提取率呈下降趨勢，這可能是因為溶劑量過大導致CA濃度下降而不利于協(xié)同浸提所致[21]。因此，液料比確定為14∶1。

由圖2-c可知，超聲時間在10～15 min時，雀嘴茶中的CA提取率隨超聲時間的延長而上升；當超聲時間為15 min時，CA提取率達到最高；當超聲時間超過15 min后，CA提取率呈逐漸下降趨勢，這可能是由于超聲時間的延長增加了超聲波的作用強度，使較多溶出的其他成分與CA競爭甲醇-水分子[20]而導致其提取率有所下降。因此，超聲時間確定為15 min。

由圖2-d可知，提取次數(shù)在1～3次時，雀嘴茶中的CA提取率隨提取次數(shù)的增加而顯著提高；提取次數(shù)超過3次后，CA提取率的增長趨勢則趨于平緩?？紤]到節(jié)約能源及成本等因素，確定提取次數(shù)為3次。

圖 2甲醇體積分數(shù)(a)、液料比(b)、超聲時間(c)和提取次數(shù)(d)對雀嘴茶CA提取率的影響

Fig.2Effects of methanol concentration (a),liquid-material ratio (b),ultrasonic time (c) and

extraction times (d) on extraction rate of CA fromV.dunalianum

2.3雀嘴茶中CA提取的響應面分析

雀嘴茶中CA提取的四因素三水平中心組合試驗結(jié)果見表2。

表 2　雀嘴茶中CA提取的中心組合試驗結(jié)果

續(xù)表 2　Continued table 2

2.3.1回歸模型的建立及顯著性檢驗對中心組合程序進行多元回歸分析，回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。由表3求得的二次回歸方程為：CA提取率=-40.250 42+0.706 96A+2.224 79B+0.514 75C+8.298 33D-6.25×10-3AB-3.05×10-3AC-0.014 125AD+4.125×10-3BC-0.072 500BD-0.022 5CD-3.420 83×10-3A2-0.049 896B2-7.283 33×10-3C2-0.783 33D2。其中A、B、C、D分別為甲醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間和提取次數(shù)的水平值。

表 3　雀嘴茶中CA提取的回歸模型的方差分析

注：***.差異極顯著P<0.001)；**. 差異高度顯著(P<0.01)。

Note: ***.Extremely significant difference (P<0.001);**.Highly significant difference (P<0.01).

由表3可以看出，回歸模型的顯著性極高(P<0.000 1)，線性關系較好(R2=0.923 1)，表明所建立的二次回歸模型成立，可用此模型來分析和預測超聲輔助提取雀嘴茶中CA的提取率。從回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果可知， 提取次數(shù)的一次項、二次項對雀嘴茶CA提取率影響極顯著，液料比一次項、甲醇體積分數(shù)二次項對CA提取率的影響高度顯著。各因素對CA提取率響應值的影響大小順序為提取次數(shù)>液料比>超聲時間>甲醇體積分數(shù)。

2.3.2響應面分析響應面圖可以反映最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用，每個響應面對其中2個因素進行分析，另外2個因素則固定在0水平上，若曲線越陡峭，則表明該因素對CA提取率的影響越大，相應表現(xiàn)為響應值變化的大小。

圖3直觀地反映了任何2個因素交互作用對雀嘴茶中CA提取率響應值的影響。由圖3-a可知，CA提取率隨液料比增加變化很大，而甲醇體積分數(shù)對CA提取率影響相對較小。由圖3-b可知，CA提取率隨超聲時間和甲醇體積分數(shù)增大變化較小，二者交互作用不明顯。由圖3-c可以看出，提取次數(shù)對CA提取率影響較大，而甲醇體積分數(shù)對其影響很小，二者交互作用不明顯。由圖3-d可知，超聲時間不變時，CA提取率隨液料比增加而上升;而液料比不變時，CA提取率隨超聲時間增加總體變化不大。由圖3-e可以看出，CA提取率隨提取次數(shù)變化很大，而隨液料比增大變化緩慢，二者交互作用不明顯。由圖3-f可知，提取時間不變時，CA提取率隨提取次數(shù)的增加變化較大，而隨超聲時間的增加無明顯變化。

圖 3各因素交互作用對雀嘴茶CA提取率的響應面圖和等高線圖

Fig.3Response surfaces and corresponding contours for the interactive effects of

different factors on extraction rate of CA fromV.dunalianum

2.3.3最佳工藝條件的確定及驗證通過Design-Expert V8.0.6軟件對回歸方程進行優(yōu)化計算，得到超聲輔助提取雀嘴茶中CA的最佳工藝條件為：甲醇體積分數(shù)72.87%，液料比15.87∶1,超聲時間18.96 min，提取次數(shù)3.63次。在此條件下，CA提取率的理論預測值為23.12%。

為檢驗響應面優(yōu)化提取工藝對雀嘴茶中CA提取效果的可靠性，同時考慮到實際操作的便利，將最優(yōu)工藝條件修正為：甲醇體積分數(shù)73%，液料比 16∶1，超聲時間19 min，提取次數(shù)4次。在此條件下超聲輔助提取CA，通過3次平行驗證試驗得其實際平均提取率為23.03%，與理論預測值較為接近(相差0.09%)，說明運用響應面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確可靠。

3討論與結(jié)論

本研究采用響應面法分析并優(yōu)化了雀嘴茶中CA的超聲輔助提取工藝，得到CA提取率4個影響因素的主次關系為：提取次數(shù)>液料比>超聲時間>甲醇體積分數(shù)，其理論最佳提取工藝條件為：甲醇體積分數(shù)72.87%、液(mL)料(g)比15.87∶1、超聲時間18.96 min、超聲次數(shù)3.63次。在此條件下，CA提取率的理論預測值可達23.12%。根據(jù)實際操作的需要，將工藝條件修正為甲醇體積分數(shù)73%、液料比16∶1、超聲時間19 min、超聲次數(shù)4次。經(jīng)驗證，此條件下CA的實際提取率為 23.03%，與理論預測值較為接近，表明采用響應面法分析并優(yōu)化的雀嘴茶CA超聲輔助提取工藝完全可行，為雀嘴茶中CA的大量生產(chǎn)及其高附加值產(chǎn)品的研發(fā)等提供了技術支持。

近年來，有關植物材料粉碎粒度對有效成分提取率影響的研究報道較多，提高粉碎粒度有助于提高有效成分的提取率，但是針對不同的植物材料或有效成分，粉碎粒度與提取率之間并不完全呈正比關系[22]。特別是對于小分子有效成分，由于其容易從細胞壁中溶出，因此粉碎粒度的提高對有效成分的提取并無明顯影響[23-24]。本研究所獲得的CA提取工藝適用于0.63 mm雀嘴茶粉末的提取，其他粉碎粒度對雀嘴茶CA提取率的影響尚有待進一步研究。

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Optimizing the extraction of 6′-O-caffeoylarbutin fromVacciniumdunalianumby response surface methodology

LI Na,DAN Han-long,LIU Yun,LUO Xu-lu,HE Peng,KAN Huan,ZHAO Ping

(KeyLaboratoryforForestResourcesConservationandUseintheSouthwestMountainsofChina,MinistryofEducation,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan650224,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to determine the optimal ultrasonicassisted extraction of 6′-O-caffeoylarbutin (CA) from Vaccinium dunalianum buds.【Method】 Ultrasonic-assisted extraction method was used to extract CA from V.dunalianum buds.The effects of methanol concentration (50%,60%,70%,80%,and 90%),liquid-material ratio (8∶1,10∶1,12∶1,14∶1,and 16∶1),ultrasonic time (10,15,20,25,and 30 min),and extraction times (1,2,3,4,and 5) on the extraction rate of CA were investigated by single factor experiments and the extraction process was optimized using response surface methodology. 【Result】 The theoretically optimum ultrasonic-assisted extraction conditions for CA were:methanol concentration 72.87%,liquid-material ratio 15.87∶1,ultrasonic time 18.96 min,and extraction number 3.63 times.Under this optimal condition,the predicted extraction rate of CA was 23.12%.According to the actual experiment,the above parameters were modified to methanol concentration 73%,liquid-material ratio 16∶1,ultrasonic time 19 min,and extraction number 4 times.The actual extraction rate of CA was 23.03%,which was close to the theoretical value. 【Conclusion】 It is feasible to use response surface method for optimization of ultrasonic-assisted extraction of CA from V.dunalianum buds.

Key words:Vaccinium dunalianum;6′-O-caffeoylarbutin;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.024

[收稿日期]2014-10-24

[基金項目]國家自然科學基金項目(21462040，31460076)；西南林業(yè)大學科技創(chuàng)新基金項目(C1463)

[作者簡介]李娜(1990-)，女，云南曲靖人，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學研究。E-mail:576909424@qq.com E-mail:hypzhao@yahoo.com

[通信作者]趙平(1965-)，男，重慶江津人，研究員，博士，博士生導師，主要從事天然產(chǎn)物化學研究。

[中圖分類號]Q946.83+9；S571.109

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0173-08

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.048.html