李平， 李小芳，向志云，李培培，周維，羅開(kāi)沛

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星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化五味子木脂素的提取工藝

李平， 李小芳，向志云，李培培，周維，羅開(kāi)沛

［摘要］目的：優(yōu)選五味子治療失眠有效部位的提取工藝。方法：采用單因素試驗(yàn)考察回流提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量、提取溫度、提取次數(shù)等對(duì)五味子總木脂素含量的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，以總木脂素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選回流提取工藝。結(jié)果：五味子治愈失眠有效部位的最佳回流提取工藝為乙醇體積85%、乙醇用量3倍、提取時(shí)間49 min、提取次數(shù)1次。結(jié)論：優(yōu)選的回流提取工藝簡(jiǎn)便易行，預(yù)測(cè)性良好，為五味子后續(xù)的劑型開(kāi)發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］五味子；有效部位；總木脂素；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

［作者單位］成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

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五味子具有益氣滋腎、生津止渴、寧心安神功效［1］，臨床用于治療心悸、失眠、多夢(mèng)、津傷口渴、消渴［2］，其改善睡眠的主要有效成分為木脂素類(lèi)［3］。目前對(duì)五味子多糖的研究報(bào)道較多，而對(duì)其木脂素活性成分的研究報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總木脂素得率為指標(biāo)，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選五味子治愈失眠的有效部位的回流提取工藝［4］，為后續(xù)的劑型開(kāi)發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料

水浴鍋，UV-6000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；DZG-6020型真空干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、BP211D AG型電子天平（德國(guó)Satorius）；UPT-I-10T型超純水器（成都超純科技有限公司）；DEY-300型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；SB-5200DT型超聲儀（200W，40 KHz；寧波新芝生物科技股份有限公司）。五味子飲片（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為五味子科植物五味子Schisandra chinensis.的成熟果實(shí)）；五味子乙素對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：Must-14041606）；所用試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取五味子乙素對(duì)照品1.9 mg，置于20 mL量瓶中，加95%乙醇使溶解并定容至刻度，即得。

2.1.1 供試品溶液的制備 稱(chēng)取五味子粗粉約2 g，精密稱(chēng)定，置于150 mL燒瓶中，精密加入60%乙醇溶液20 mL，在90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱回流1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液，取適量用95%乙醇定容至一定刻度即得。

2.1.2 線性關(guān)系考察 利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在278 nm處有最大吸收［5］。精密吸取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，分別置于5 mL量瓶中，各加入95%乙醇并定容至刻度，于278 nm處測(cè)定吸光度（A），以A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=8.847X+0.003（r =0.9995），線性范圍0.019～0.095 mg.mL-1。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密量取五味子乙素對(duì)照品溶液2 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果A的RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液2 mL，分別于0，5，10，15，20，25 h按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果A的RSD 為0.95%，表明供試品溶液至少在25 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份五味子提取液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果總木脂素提取率的RSD為 1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知提取率的同一五味子提取液6份，每份1 mL，各加入已精密量取的五味子乙素對(duì)照品溶液1mL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定A，計(jì)算平均加樣回收率，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

由表可知，平均加樣回收率為1.25%。

2.2 單因素試驗(yàn)考察

選取提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量等為考察因素，每個(gè)因素各設(shè)5個(gè)不同水平，分別稱(chēng)取五味子飲片1 g進(jìn)行提取工藝考察。

2.2.1 提取時(shí)間 規(guī)定提取溫度90 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:10，選取提取時(shí)間為30，60，90，120，150 min的5個(gè)水平分別進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總木脂素對(duì)應(yīng)的A隨提取時(shí)間的改變而呈現(xiàn)一定的變化，并在150 min時(shí)A最低，30 min時(shí)A最高。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定提取溫度90 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1:10，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%，80%，90%的5個(gè)水平分別進(jìn)行考察，結(jié)果可知當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，總木脂素有最大A。2.2.3 溶劑用量 固定提取溫度90 ℃，提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，選取料液比1:10，1:14，1:18，1:22，1:26的5個(gè)水平分別進(jìn)行考察，結(jié)果顯示當(dāng)料液比1:10時(shí)總木脂素有最大A，之后A隨比值的變小而變小，故選擇10倍量的溶劑用量。

2.2.4 提取溫度 固定提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:10，選取50，60，70，80，90 ℃共5個(gè)水平進(jìn)行考察，結(jié)果顯示各溫度下測(cè)得的A變化不大，但當(dāng)提取溫度為90℃時(shí)，總木脂素有最大A。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)［6］

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量進(jìn)行三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，以總木脂素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用效應(yīng)面法優(yōu)化五味子的提取工藝。因?yàn)樘崛〈螖?shù)為非連續(xù)變量，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)，將提取次數(shù)先暫定為1次。因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 五味子有效部位回流提取工藝因素水平

表3 五味子有效部位回流提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)安排

注：15～20號(hào)為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用平均值表示。

2.3.1 統(tǒng)計(jì)分析 以總木脂素得率為因變量（Y），X1，X2，X3為自變量，采用Design-Expert8軟件進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，擬合模型，多元線性回歸：r=0.462，P=0.045＞0.01，模型不能通過(guò)檢驗(yàn)，模型擬合度不高，預(yù)測(cè)性也不好，因此不采用線性模型擬合。二項(xiàng)式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9372，P＜0.0001，各項(xiàng)方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，各因素中一次項(xiàng)、二次項(xiàng)都具有顯著性差異，再次說(shuō)明具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)效應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。最后選擇二項(xiàng)式擬合模型為成功模型。

表4 五味子回流提取工藝多元二項(xiàng)擬合方程方差分析

2.3.2提取工藝的優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)已經(jīng)確定的方程為模型，固定3個(gè)自變量之一為中值，以總木脂素得率為因變量，繪制效應(yīng)面的三維圖，見(jiàn)圖1～3，結(jié)果得最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間49 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為84.52%，乙醇用量為3.07倍。為便于實(shí)際操作，最后將參數(shù)確定為加3倍量的85%乙醇提取49 min。

圖1 表示乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總木脂素得率的影響

圖2 表示乙醇體積分?jǐn)?shù)和用量對(duì)總木脂素得率的影響

圖3 表示乙醇用量和提取時(shí)間對(duì)總木脂素得率的影響

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果平均得率 30%，與預(yù)測(cè)值的偏差1.6%，實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值基本吻合說(shuō)明建立的數(shù)學(xué)模型可靠，預(yù)測(cè)性良好。

3　討論

研究報(bào)道表明五味子木脂素類(lèi)化合物具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗氧化等藥理活性［7］。五味子中木脂素類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)成分具有縮短潛睡期，改善睡眠作用，還有能抑制腫瘤細(xì)胞行為［8］。五味子中木脂素類(lèi)成分的提取有采用水煎法、乙醚回流提取以及超聲提取法［9］。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明五味子木脂素類(lèi)成分適宜用乙醇進(jìn)行回流提取。利用乙醇對(duì)五味子粗粉進(jìn)行回流提取，操作方便可控，且提取快速，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

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（責(zé)任編輯：傅舒）

Optimize the extraction process of Wuweizi lignans by central composite design - response surface methodology

LIPing， LI Xiao-fang， XIANG Zhi-yun， LI Pei-pei， ZHOU Wei， LUO Kai-pei//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， Sichuan）

［Abstract］Objective: To optimize extraction process of effective parts of Wuweizi for curing insomnia. Method: Singlefactor tests were adopted to investigate effects of extraction time， ethanol concentration， solvent dosage， extraction temperature and extraction times on contents of total lignans in Wuweizi. Based on single factor tests， ethanol concentration， solvent dosage and extraction time were used as factors （five levels for each factor）， then extraction process of effective parts in Wuweizi for curing insomnia was optimized by central composite design-response surface methodology with extraction efficiency of total lignans as evaluation indicator. Result: Optimum extraction process was as follows: extracted 49 min with 3 volumes of 85% ethanol at 90℃，1 time. Conclusion: Optimized extraction process is simple and feasible with good predictability. It can provide experimental evidence for formulations development and industrial production of Wuweizi.

［Key words］Wuweizi； effective parts； total lignans； central composite design-response surface methodology

［中圖分類(lèi)號(hào)］R283.6

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-012-03

［作者簡(jiǎn)介］李 平，在讀碩士研究生；研究方向：中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

［通訊作者］李 小芳，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

［收稿日期］2015-01-07