張　濤　宋慶嬌　榮光影　柳朝陽　汪　悅

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

川芎嗪對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響

張濤宋慶嬌榮光影1柳朝陽2汪悅3

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究川芎嗪(TMP)對(duì)Hela細(xì)胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)TMP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western印跡法檢測(cè)p-Bad和Survivin蛋白的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比TMP可抑制Hela細(xì)胞的增殖(P<0.01)；增加Hela細(xì)胞的凋亡率(P<0.05，P<0.01)；降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論TMP可抑制Hela細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)，這可能是TMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕川芎嗪；宮頸癌；細(xì)胞凋亡；磷酸化Bad蛋白；Survivin蛋白

川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體，臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1，2〕。目前報(bào)道，TMP的抗腫瘤〔3～7〕作用主要見于對(duì)肺癌、白血病、黑色素細(xì)胞瘤和胃癌的抑制作用，TMP對(duì)宮頸癌的抑制及其作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外暫無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料細(xì)胞株：Hela細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。 藥物和試劑：TMP純品購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)公司。AV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、兔抗人Survivin抗體和抗人β-actin抗體、Bad蛋白磷酸化(p-Bad)抗體購(gòu)于艾美捷科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞復(fù)蘇后，RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖胰酶消化調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h，分別給予不同濃度的TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別處理(24、48、72)后進(jìn)行檢測(cè)，加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μl DMSO，于490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，有細(xì)胞，無藥物。細(xì)胞增殖抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值)×100%。

1.2.3膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V FITC)染色流式細(xì)胞儀觀察Hela細(xì)胞凋亡Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后加入TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)，培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，利用FCSExpress 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.2.4Western印跡法檢測(cè)Survivin及p-Bad蛋白表達(dá)收集對(duì)照組及TMP(1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理的Hela細(xì)胞，提取總蛋白，用Bradford法測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量。蛋白上樣后，進(jìn)行凝膠電泳，移膜，4℃用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗人抗體(1∶100)，過夜，加二抗(1∶10 000)，雜交1 h。采用ECL法分析檢測(cè)結(jié)果，以β-actin為對(duì)照蛋白，各組蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算Survivin和p-Bad蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.3軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1TMP抑制Hela細(xì)胞增殖MTT法結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞可明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.01)；各時(shí)間點(diǎn)均以2.0 mg/ml濃度的抑制率最高，具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。見表1。

2.2TMP對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率的影響不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死細(xì)胞逐漸上升(P<0.05，P<0.01)(0.25 mg/ml組除外)，具有濃度依賴性，見表2。

2.3TMP對(duì)Hela細(xì)胞p-Bad蛋白及Survivin蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細(xì)胞48 h后，可見隨藥物濃度的增高，p-Bad蛋白及Survivin蛋白的表達(dá)逐漸降低，呈一定的濃度依賴性，見表3。

表1　不同濃度的TMP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較:1)P<0.01

表2　TMP對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

表3　TMP對(duì)Hela細(xì)胞磷酸化Bad蛋白和Survivin

與對(duì)照組比較:1)P<0.01；與TMP 0.25 mg/ml組比較:2)P<0.01；與TMP 1.0 mg/ml組比較:3)P<0.05

3討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一，死亡率占女性癌癥的第二位〔8〕。研究證明，500 mg/L TMP對(duì)人胃低分化腺癌有一定殺傷作用，抑制率約為24.4%～28.5%〔3〕；TMP能輕度抑制敏感性白血病K562細(xì)胞的DNA合成〔4〕；≥250 mg/L的TMP對(duì)體外培養(yǎng)的B16-FIO黑色素瘤細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成具有抑制作用，并存在劑量依賴關(guān)系〔5〕；TMP對(duì)肺癌A549細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的〔6〕；TMP通過誘導(dǎo)Bel-7402肝癌細(xì)胞株分化抑制細(xì)胞增殖〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TMP能夠抑制Hela細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Bad是 Bcl-2家族中的促凋亡基因。Bad在多種細(xì)胞中表達(dá)，研究表明Bad可通過與Caspase家族成員的相互作用和作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞凋亡全過程。接受細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激后，鈣調(diào)磷酸酶可誘導(dǎo) Bad去磷酸化，去磷酸化的游離 Bad 通過易位等細(xì)胞活動(dòng)促進(jìn)凋亡的發(fā)生〔9〕。

Bad蛋白對(duì)凋亡的調(diào)控與其磷酸化-去磷酸化修飾有關(guān)，生理狀態(tài)下，p-Bad一方面與 14-3-3 蛋白結(jié)合成復(fù)合物穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)；另一方面，p-Bad與bcl-2解聚，而游離的bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用〔10〕。

Survivin是抗凋亡蛋白家族(IAP)中最小的一個(gè)抗凋亡基因，在正常組織(子宮內(nèi)膜等少數(shù)組織除外)不表達(dá)，而在多種腫瘤組織中呈周期依賴性的表達(dá)〔11〕。

Survivin通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體的釋放從而在上游就阻斷了凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)；Survivin能夠阻止Caspase-9前體構(gòu)象的改變，進(jìn)而阻止下游Caspases分子前體蛋白的分解，且Survivin可與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。本研究結(jié)果提示TMP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，與其降低抗凋亡蛋白p-Bad和Survivin表達(dá)有關(guān)。

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〔2015-10-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015074)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2009-336)；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1252G059)；佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Sz2011-009)；佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510222026)

通訊作者：柳朝陽(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R73-36

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2605-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.016

1佳木斯大學(xué)醫(yī)政管理處2佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

3佳木斯大學(xué)2014級(jí)免疫學(xué)碩士

第一作者：張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機(jī)制方面的研究。