李鳳英　楊　楊　李鑫屹　李　玥　黃校青　朱秀琳　楊　哲　劉星吾　張　琪　許珊珊　李　宇洛桑曲珍　徐金銘　王偉群　賈琳琳

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

外源性IL-8上調(diào)其受體表達(dá)促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖

李鳳英1楊楊李鑫屹李玥黃校青朱秀琳楊哲劉星吾張琪許珊珊李宇洛桑曲珍徐金銘王偉群賈琳琳

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究白細(xì)胞介素(IL)-8及其受體(R)A和B mRNA在Hela宮頸癌細(xì)胞株的表達(dá)及外源性IL-8對(duì)Hela細(xì)胞增殖的作用。方法實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)IL-8及IL-8RA和IL-8RB 在Hela細(xì)胞的表達(dá)；MTT法檢測(cè)不同濃度的外源性IL-8對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR方法檢測(cè)外源性IL-8對(duì)IL-8RA和IL-8RB表達(dá)的影響。結(jié)果Hela細(xì)胞表達(dá)IL-8及IL-8RA和IL-8RB，并且IL-8RA的表達(dá)量明顯高于IL-8RB；外源性IL-8可顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖，并明顯上調(diào)IL-8RA和IL-8RB的表達(dá)。結(jié)論外源性IL-8可通過(guò)上調(diào)Hela細(xì)胞IL-8RA 和 IL-8RB的表達(dá)而促進(jìn)其增殖。

〔關(guān)鍵詞〕宮頸癌；白細(xì)胞介素(IL)-8；IL-8RA；IL-8RB

宮頸癌發(fā)病率已居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位，并位于女性所有惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位〔1〕。宮頸癌的發(fā)病率有明顯的地區(qū)和國(guó)籍差別，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)女性中宮頸癌發(fā)病率最高，已位列世界第一位。目前認(rèn)為宮頸癌的發(fā)病與炎癥、早婚、早育及多產(chǎn)等因素有關(guān)。白細(xì)胞介素(ILs)是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的、具有多種生物學(xué)效應(yīng)的一類細(xì)胞因子，在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖及免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。ILs可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤的增殖、存活、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生等多種生物學(xué)行為〔2～7〕。本研究探討IL-8及其受體(R)A和B在Hela宮頸癌細(xì)胞株的表達(dá)及IL-8對(duì)Hela細(xì)胞增殖的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑及儀器Hela細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)；青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)公司)；胰蛋白酶(武漢博士德生物工程有限公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒，PCR mix，D2000(北京天根生化科技有限公司)；重組人IL-8(美國(guó)PeproTech公司)；CCK8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(北京金西盟儀器有限公司)；超級(jí)潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)有限公司)；PCR儀(德國(guó)Biometra Tprofessional公司)；電子精密天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1.2RT-PCR檢測(cè)IL-8 及其受體mRNA在Hela細(xì)胞的表達(dá)用Trizol試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定OD值并計(jì)算RNA濃度。RNA濃度計(jì)算公式為：μg/μl= 40×OD260×稀釋倍數(shù)/1 000。將模板RNA按下列操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：向無(wú)核酸酶的離心管中加入以下反應(yīng)物：2 μg總RNA，2 μl Oligo(dT)15，2 μl Super Pure dNTP；最后加入RNase-Free ddH2O，使總體積定容至14.5 μl；70℃加熱5 min并迅速置于冰浴冷卻2 min；短暫離心后加入4 μl 5×First-Strand緩沖液和0.5 μl Rnasin；加入1 μl TIANScript M-MLV，輕輕混勻；42℃水浴50 min；95℃加熱50 min以終止反應(yīng)；將凍存管置于-80℃凍存?zhèn)溆?。查閱Genebank登陸的β-actin、IL-8、IL-8RA和IL-8RB的mRNA序列，依照PCR引物設(shè)計(jì)原則，用Primer 5軟件基因的正向和反向引物。引物序列如下，β-actin：正向引物，5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，反向引物，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。IL-8：正向引物，5′ACATACTCCAAACCTTTCCACC-3′，反向引物，5′-AAAACTTCTCCACAACCCTCTG-3′。IL-8RA：正向引物，5′-GACCTACTCTTTGCCCTGAC-3′，反向引物，5′-AACACCATCCGCCATTTT-3′。IL-8RB：正向引物，5′-GGAAACTCCCTCGTGATG-3，反向引物，5′-CAGGAATGTGCCAAAAAT-3′。各基因PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。將6 μl各基因產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍攝及分析結(jié)果。

表1　PCR反應(yīng)條件

1.3生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)將Hela細(xì)胞重懸于含10%FBS 和100 U/ml青鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基并接種于96孔板中，細(xì)胞懸液量和細(xì)胞數(shù)分別為100 μl/孔和1.5×103個(gè)/孔；孔板置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞完全貼壁后，將孔板中細(xì)胞隨機(jī)分成5組，每組7孔，分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1、2、3和4，并更換新鮮條件培養(yǎng)基〔對(duì)照組新鮮條件培養(yǎng)基為1640完全培養(yǎng)基+0.1%牛血清白蛋白(BSA)；實(shí)驗(yàn)組新鮮條件培養(yǎng)基為1640完全培養(yǎng)基+溶于0.1% BSA的外源性重組人IL-8，以保證實(shí)驗(yàn)組1、2、3和4的IL-8終濃度分別為10、20、40、60和80 ng/ml〕；自更換培養(yǎng)基起，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Hela細(xì)胞表達(dá)IL-8 及其受體IL-8RA和IL-8RB mRNAIL-8 及IL-8RA和IL-8RB mRNA在Hela細(xì)胞中均有表達(dá)，見(jiàn)圖1。IL-8RA與IL-8RB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(4 264.67±505.80)和(1 644.33±320.72)，兩者差異顯著(P<0.01)。

圖1　IL-8 及IL-8RA和IL-8RB mRNA在Hela細(xì)胞中的表達(dá)

2.2外源性IL-8促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖 MTT結(jié)果IL-8終濃度為0、20、40、60和80 ng/ml的吸光度值分別為(1.08±0.12)、(1.12±0.14)、(1.28±0.04)、(1.34±0.06)和(1.27±0.06)，該數(shù)值可表示細(xì)胞的增殖情況。與0 ng/ml IL-8比較，當(dāng)IL-8終濃度為40、60和80 ng/ml時(shí)可顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖(P<0.05，P<0.01)；終濃度從20 ng/ml到60 ng/ml的促Hela細(xì)胞增殖效應(yīng)具有劑量依賴性；終濃度增至80 ng/ml時(shí)，增殖率有所降低，但與60 ng/ml比較，40和80 ng/ml的增殖率無(wú)顯著性差異。

2.3外源性IL-8上調(diào)IL-8RA和IL-8RB的表達(dá)IL-8終濃度為0、60和80 ng/ml組的IL-8RA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.70±0.04)、(0.88±0.05)和(1.58±0.09)，而IL-8RB相對(duì)表達(dá)量分別為(0.54±0.04)、(0.84±0.03)和(0.78±0.05)。外源性IL-8可上調(diào)其受體L-8RA和IL-8RB的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2　外源性的IL-8上調(diào)IL-8RA和IL-8RB的表達(dá)

3討論

IL-8 是具有誘導(dǎo)細(xì)胞做定向移動(dòng)的細(xì)胞因子，屬于 CXC(C為半胱氨酸，X為任意氨基酸)類趨化因子家族成員，故又名CXCL8。研究表明〔8，9〕，IL-8 可通過(guò)MAPK/ERK和 PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑經(jīng)自分泌和旁分泌機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞增殖。Milliken等〔10〕報(bào)道高表達(dá)CXCL8的卵巢癌上皮細(xì)胞株的增殖速度明顯快于低表達(dá)CXCL8的細(xì)胞株。Inoue等〔11〕的研究表明高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M-LN4的IL-8表達(dá)量明顯高于低轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3P。將PC-3P和PC-3M-LN4細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)有意義IL-8序列和全長(zhǎng)反義IL-8序列，體外實(shí)驗(yàn)顯示，PC-3P細(xì)胞過(guò)表達(dá)IL-8可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9和膠原蛋白酶活性，并且其通過(guò)基質(zhì)膠的能力明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染反義IL-8序列的PC-3M-LN4細(xì)胞的IL-8和MMP-9表達(dá)量、膠原蛋白酶活性及細(xì)胞通過(guò)基質(zhì)膠的能力都較對(duì)照組有所降低。在PC-3P細(xì)胞過(guò)表達(dá)IL-8可明顯促進(jìn)其在裸鼠體內(nèi)的致瘤性、轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生。

本研究結(jié)果與上述腫瘤中的研究結(jié)果相一致〔8～11〕，即外源性IL-8可促明顯進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖，并表現(xiàn)為劑量依賴性，當(dāng)IL-8濃度大于40 ng/ml時(shí)，其促進(jìn)增殖效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，當(dāng)IL-8的濃度升至80 ng/ml時(shí)，其增殖效率較40 ng/ml和60 ng/ml的IL-8有所降低。以往的實(shí)驗(yàn)也表明〔12〕，同為CXC類趨化因子的CXCL5，當(dāng)其濃度增加至一定范圍時(shí)，也具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。目前仍然不清楚造成此結(jié)果的原因，推測(cè)IL-8可能對(duì)MAPK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)具有雙向調(diào)節(jié)作用，即超高濃度的IL-8可抑制MAPK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路，從而使其促進(jìn)增殖作用有所減弱。IL-8的腫瘤促進(jìn)作用是通過(guò)其受體介導(dǎo)的。本文結(jié)果表明，IL-8對(duì)其兩種受體均具有正向調(diào)節(jié)作用。在肺癌中，癌組織高表達(dá)的IL-8RA和IL-8RB可使癌細(xì)胞對(duì)IL-8的反應(yīng)性增強(qiáng)，從而最大限度地發(fā)揮IL-8的促癌作用〔13〕。由此推斷IL-8促Hela細(xì)胞增殖作用部分地是通過(guò)上調(diào)IL-8RA和IL-8RB而發(fā)揮的。在今后利用轉(zhuǎn)染等手段繼續(xù)通過(guò)自分泌和旁分泌在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展IL-8在宮頸癌中的作用，以期更深入探討IL-8的作用機(jī)制，為臨床診斷和治療宮頸癌提供新的檢測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

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〔2014-11-25修回〕

(編輯苑云杰)

Exogenous IL-8 up-regulates the expression of its receptor and promotes proliferation of uterine cervix cancer Hela cell

LI Feng-Ying, YANG Yang, LI Xin-Yi,et al.

The Basic Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate mRNA expressions of IL-8 and its receptors IL-8RA and IL-8RB in Hela uterine cervix cancer cell line and the effect of exogenous IL-8 on the proliferation of Hela cell.MethodsThe expressions of IL-8 and IL-8RA and IL-8RB were detected by RT-PCR assay; the influence of different concentrations of exogenous IL-8 on proliferation of Hela cell was detected by MTT assay; the effects of exogenous IL-8 on the expressions of IL-8RA and IL-8RB were detected by RT-PCR assay.ResultsIL-8 and IL-8RA and IL-8RB were expressed in Hela uterine cervix cancer cell line, and the expression level of IL-8RA was significantly more than that of IL-8RB; exogenous IL-8 significantly promoted proliferation of Hela cell and up-regulated the expression of IL-8RA and IL-8RB.ConclusionsExogenous IL-8 could up-regulate the expressions of IL-8RA and IL-8RB and ultimately promote proliferation of Hela cell.

【Key words】Uterine cervix cancer; IL-8；IL-8RA; IL-8RB

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81272854)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.D201129)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201410222036)；佳木斯大學(xué)科研項(xiàng)目(No.Sz2009-008)；佳木斯大學(xué)生科技創(chuàng)新面上項(xiàng)目(No.XSYM2014-008)

通訊作者：王偉群(1974-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理生理學(xué)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R737.33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2603-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.015

1佳木斯市婦幼保健院婦產(chǎn)科

賈琳琳(1975-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事聽(tīng)覺(jué)生理研究。

第一作者：李鳳英(1974-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事女性生殖系統(tǒng)病理生理學(xué)研究。