魯文英

【摘 要】多倍體育種作為一種重要的育種手段，目前已被廣泛應(yīng)用，其中倍性鑒定是多倍體育種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行倍性鑒定對(duì)加速育種進(jìn)程有重要的意義。本文概括了目前最常用的幾種多倍體鑒定方法，并對(duì)各自優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要比較。

【關(guān)鍵詞】植物；多倍體；鑒定

多倍體植物通常具有生物產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、有效成分含量高等特征，然而僅靠染色體自然加倍很難滿足現(xiàn)代植物育種的需要。為此，人為通過(guò)物理方法、化學(xué)方法、生物學(xué)方法等途徑使植物細(xì)胞染色體組加倍，獲得多倍體材料，用以選育符合人們需要的優(yōu)良品種，是近年來(lái)植物育種研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前，育種學(xué)家已在150屬的若干種上進(jìn)行了研究，并已誘導(dǎo)出許多多倍體。

一批二倍體材料經(jīng)處理后，其中一些材料的染色體加倍成為多倍體，一些未能加倍依然為二倍體，還有一些為混倍體，因此，準(zhǔn)確地辨認(rèn)多倍體并將其挑選出來(lái)，是多倍體育種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前常用的鑒定方法主要有以下幾種：

1 植株形態(tài)學(xué)鑒定

隨著細(xì)胞染色體倍性的增加，植物細(xì)胞和各器官體積一般趨于增大，表現(xiàn)出莖桿粗壯，葉色變深，葉片變厚，生長(zhǎng)緩慢，多倍體的花、果實(shí)一般均比二倍體的大，而且花瓣肥厚，花色較鮮艷。因此，巨型性是多倍體植物最為顯著的外部形態(tài)特征。

蘋果多倍體植株外觀具有莖矮、粗壯、節(jié)間短、葉寬圓、葉片厚、葉色濃綠、葉脈突起等形態(tài)特征[1]。穎長(zhǎng)可以作為水稻染色體倍數(shù)的又一指標(biāo)，水稻單倍體與二倍體的穎長(zhǎng)一般以5.6㎜為界，二倍體與三倍體的穎長(zhǎng)以7.8㎜為界[2]。黃瓜單倍體與雙單倍體雌、雄花花冠具有明顯區(qū)別：?jiǎn)伪扼w花冠深裂，而雙單倍體花冠淺裂，可以作為區(qū)別單倍體和雙單倍體植株的標(biāo)志，單倍體能結(jié)果，但果形多異常，無(wú)正常種子，多空癟籽，雙單倍體種子飽滿[3]。

根據(jù)植株外部形態(tài)特征進(jìn)行鑒定是初步鑒定多倍體的主要方法，也是最直觀，最粗放的方法，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，不需要任何儀器，可以在苗期做出早期鑒定，為育種工作者減輕工作量。不足之處是存在很大的經(jīng)驗(yàn)因素，可能會(huì)因人而異，鑒定的準(zhǔn)確度不高。

2 染色體計(jì)數(shù)法鑒定

染色體計(jì)數(shù)法通常有常規(guī)壓片法和去壁低滲法兩種。

壓片法一般以根尖、莖尖、卷須、愈傷組織等為材料，用醋酸洋紅或蘇木精等染色壓片，觀察細(xì)胞分裂中期的染色體并計(jì)數(shù)，制片中需要很好的操作技能。

陳瑞陽(yáng)等在國(guó)內(nèi)首創(chuàng)利用去壁低滲法進(jìn)行染色體標(biāo)本制備，并對(duì)37科105種植物進(jìn)行切片制備，總結(jié)了不同植物的低滲、酶解和染色時(shí)間[4]。

去壁低滲法與常規(guī)壓片法相比有許多優(yōu)點(diǎn)，既可用于染色體計(jì)數(shù)，也可用于染色體組型分析Gimsa分帶等研究，并可借助掃描電鏡對(duì)植物染色體進(jìn)行觀察，但是酶解去壁成功與否的關(guān)鍵在于對(duì)酶液濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度等幾個(gè)因素的把握，需要一定經(jīng)驗(yàn)，而且操作過(guò)程繁瑣，工作量大，所以該方法需要良好的實(shí)驗(yàn)條件和豐富的經(jīng)驗(yàn)[5]。

3 植株葉片氣孔性狀鑒定

染色體倍性與氣孔性狀的關(guān)系已有很多研究報(bào)道，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目受染色體控制，能反映植株倍性，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度是受染色體倍性控制的一對(duì)相對(duì)穩(wěn)定的性狀，年份間差異變化不顯著[6]，并且同一植物處于相同環(huán)境條件和發(fā)育階段，同一部位的保衛(wèi)細(xì)胞大小性狀是相對(duì)穩(wěn)定的[7]。

玉米花藥培養(yǎng)的再生植株進(jìn)行倍性鑒定，可結(jié)合采用根尖染色體壓片法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度法兩種方法鑒定，得出玉米單倍體植株的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是氣孔保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度不超過(guò)29um，其鑒定精度可達(dá)到95%以上[8]。青花菜小孢子培養(yǎng)獲得的植株葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)占保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)的比率（葉綠體/保衛(wèi)細(xì)胞）為8.3，13.6，22.1，和30.7，分別代表單倍體、二倍體、四倍體和八倍體[9]。李赟等以蘋果和梨的二倍體和多倍體為材料，比較了氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目、氣孔密度、氣孔長(zhǎng)和氣孔寬四個(gè)性狀與倍性的關(guān)系，分析各個(gè)性狀用于倍性鑒定的可靠性，并采用兩類性狀同時(shí)進(jìn)行判別分析，建立判別方程，結(jié)果表明，葉綠體數(shù)目和氣孔長(zhǎng)鑒定倍性的可靠性較高，如以這兩個(gè)性狀進(jìn)行判別分析，蘋果判別方程鑒定倍性的可靠性與以氣孔長(zhǎng)鑒定倍性的可靠性相似，梨的判別方程可大大提高鑒定的可靠性[10]。

利用植株葉片氣孔性狀鑒定倍性簡(jiǎn)單易行，只需幾分鐘就可鑒定一份材料，且不需要先進(jìn)的儀器，不失為倍性鑒定的一種簡(jiǎn)單有效方法。

4 花粉形態(tài)學(xué)鑒定

花粉的形態(tài)特征受植物基因型控制，不同倍性花粉的大小、萌發(fā)孔數(shù)量形態(tài)、紋孔、紋飾等都存在差異，花粉形態(tài)特征比起解剖結(jié)構(gòu)更少受外界條件影響，是探討植物起源、演化及親緣關(guān)系的重要特征之一。

花粉粒的大小與染色體數(shù)目的正相關(guān)性已經(jīng)完全得到證實(shí)，四倍體花粉一般比二倍體大20%-30%[11]。以不同倍性苧麻為材料，對(duì)其花粉粒形狀、大小進(jìn)行比較觀察，結(jié)果表明：花粉大小與染色體倍性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9708，單倍體、二倍體、三倍體和四倍體平均直徑分別為16.30、17.81、22.00、24.76微米，品種對(duì)這一性狀沒(méi)有影響，單倍體花粉大小變化較大，并且存在一定數(shù)量的畸形、空殼花粉；三倍體存在少量的小?；ǚ踇12]。采用掃描電子顯微鏡對(duì)二倍體、三倍體和四倍體甜菜的花粉進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果表明：三種甜菜花粉在花粉粒的形狀、萌發(fā)器官類型及表面紋飾等主要性狀上均為相同；不同染色體倍性品種的花粉之間，在花粉粒的體積、萌發(fā)孔的數(shù)量、孔口直徑和孔膜表面紋飾等方面亦有一定差別[13]。

5 流式細(xì)胞儀法鑒定

流式細(xì)胞儀法是目前最快速且有效的倍性鑒別方法，它可以直接測(cè)定細(xì)胞的DNA含量，從而快速鑒別植株的染色體倍性水平。通過(guò)流式細(xì)胞分析儀對(duì)大量處于分裂間期染色體的DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析，繪制出DNA含量（倍性）的分布曲線圖。

流式細(xì)胞儀可以對(duì)幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行倍性檢測(cè)，并且除了檢測(cè)單倍體和多倍體等整倍體外，還能很好地鑒別出再生植株中少量混倍體、非整倍體類型的細(xì)胞，避免傳統(tǒng)檢測(cè)方法由于觀察數(shù)量的局限導(dǎo)致的檢測(cè)誤差[14]。此外該法不受植物體取材部位和細(xì)胞所處的時(shí)期限制，取材部位可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等，而且只需要少量材料，不影響植物生長(zhǎng)。但該方法的不足是測(cè)定費(fèi)用較高，對(duì)于一般育種單位來(lái)說(shuō)是難以承受的，此外，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)，樣品準(zhǔn)備時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，在室溫條件下，樣品準(zhǔn)備時(shí)間不宜超過(guò)20分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致測(cè)定時(shí)DNA峰值的位置發(fā)生偏移，從而影響測(cè)定結(jié)果[15]。

綜上所述，幾種常用的倍性鑒定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)不同植物材料特點(diǎn)，結(jié)合試驗(yàn)單位自身情況，探索最有效、最直接的方法進(jìn)行倍性鑒定，快速篩選出多倍體植株，加速多倍體育種進(jìn)程。

【參考文獻(xiàn)】

[1]石蔭坪，王強(qiáng)生，周廣芳，等.蘋果試管苗染色體工程育種[J].落葉果樹(shù)，1993（4）：1-5.

[2]Nakamura K. Identification of ploidy level of the regeneratied plants by anther culture in rice[J]. Breeding Science， 1994， 44（1）： 19-22.

[3]韓毅科，杜勝利，王鳴.黃瓜染色體制片及倍性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003，18（1）：72-74[100].

[4]陳瑞陽(yáng)，宋文芹，李秀蘭.植物染色體標(biāo)本制備的去壁、低滲法及其在細(xì)胞遺傳學(xué)中的意義[J].遺傳學(xué)報(bào)，1982，9（2）：151-159.

[5]張海洋，裴新涌，張?zhí)煺?，?棉花單倍體植株染色體加倍研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（7）：10-12.

[6]胡含，王恒立.植物細(xì)胞工程與育種[M].北京：北京工業(yè)大學(xué)出版社，1990：394-400.

[7]王培，陳玉蓉，范光年，等.小麥花粉植株中保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度的分布[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1989，4（3）：6-10.

[8]李春紅，孟祥啟.玉米花藥培養(yǎng)及再生植株倍性鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1993，8（2）：64-68.

[9]Choi Miyong，Improvement of chloroplast observation technique in guard cells for ploide detection of microspore derived plants in broccoli[J]. Journal of the Korean Society for Horticultural Science， 1997， 38（6）： 666-669.

[10]李赟，石蔭坪，束懷瑞，等.應(yīng)用氣孔性狀對(duì)蘋果和梨的倍性判別分析[J].果樹(shù)科學(xué)，1999，16（1）：9-13.

[11]楊曉紅.蘋果屬植物花粉觀察研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1986（2）：121-129.

[12]晏春耕，曹瑞芳，李宗道，等.苧麻花粉形態(tài)學(xué)與倍性的相關(guān)性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：47-49.

[13]宛濤，許紅春.不同染色體倍性甜菜花粉形態(tài)觀察[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1996，17（2）：21-24.

[14]陳斌.辣椒花藥培養(yǎng)再生植株染色體倍數(shù)檢測(cè)研究[J].辣椒雜志，2005，4：28-30.

[15]周元昌.S.KENNEDY，抱子甘藍(lán)花培苗倍性的快速鑒定[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，31（1）：55-58.

[責(zé)任編輯：楊玉潔]