金夢凡　王晨陽　呂美君　雷小玲　尹爭志

【摘 要】斑馬魚作為一類脊椎模式動(dòng)物，具備體型小、傳代周期短、繁殖率高、體外受精發(fā)育、胚胎透明、飼養(yǎng)管理方便等優(yōu)勢，在毒理學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，斑馬魚已被廣泛用于環(huán)境毒理學(xué)、病理毒理學(xué)、胚胎發(fā)育毒理學(xué)等方面的研究，初步展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢，本文綜述了斑馬魚在毒理學(xué)研究中的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】斑馬魚；毒理學(xué)；進(jìn)展

【Abstract】Zebrafish belongs to a kind of model vertebrate animals， and zebrafish plays more and more important role in the field of toxicology research due to the advantages including small size， short period of subculture， high reproduction， in vitro fertilization and development， transparent embryos， convenient feeding and management， etc. Zebrafish has been widely used in the field of environmental toxicology， pathology toxicology， embryonic development toxicology and other fields， and shows its unique advantages. In this paper， the development of zebrafish in toxicology is reviewed.

【Key words】Zebrafish； Toxicity assessment； Progress

0 引言

斑馬魚屬熱帶淡水魚，全身布滿多條深藍(lán)色縱紋似斑馬，成群游動(dòng)時(shí)猶如奔馳的斑馬群，故稱作斑馬魚。斑馬魚常年產(chǎn)卵，成熟雌魚兩周可產(chǎn)卵幾百枚，卵在體外受精、發(fā)育，胚胎發(fā)育同步、速度快，3到4個(gè)月即可達(dá)到性成熟，成魚體長3至4厘米、體型纖細(xì)。斑馬魚對(duì)生存水質(zhì)要求不高，適宜水溫為25～31℃。目前，斑馬魚遺傳圖譜已經(jīng)建立，分析了有價(jià)值的突變體，發(fā)展了轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)，其中透明斑馬魚得到了大力推廣，這些都提供了良好的毒理學(xué)研究平臺(tái)。斑馬魚己被廣泛應(yīng)用于遺傳和發(fā)育、環(huán)境、病理等毒理學(xué)研究領(lǐng)域，展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢。

1 斑馬魚評(píng)價(jià)生殖和發(fā)育毒理效應(yīng)

1.1 斑馬魚評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育毒性

斑馬魚胚胎透明和體外發(fā)育，便于在正常生長發(fā)育及外源物質(zhì)的處理下，觀察發(fā)育進(jìn)程變化。在胚胎發(fā)育的致畸或致死原因中，血管、心臟和神經(jīng)發(fā)育是最主要的三個(gè)方面，一直處于研究熱點(diǎn)，然而斑馬魚胚胎在這三個(gè)方面的研究應(yīng)用尚屬起步階段。同時(shí)，斑馬魚具有學(xué)習(xí)、記憶、群聚、晝夜節(jié)律等復(fù)雜行為，國內(nèi)外學(xué)者已用該模型進(jìn)行神經(jīng)發(fā)育毒理學(xué)研究，以探討神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制與治療方法[1]。

1.2 斑馬魚在神經(jīng)毒性方面的應(yīng)用

斑馬魚具有敏感的腦神經(jīng)系統(tǒng)，生命早期即可呈現(xiàn)典型的運(yùn)動(dòng)模式，如自主性收縮、碰觸反應(yīng)、泳動(dòng)等。自發(fā)性運(yùn)動(dòng)可以作為多巴胺神經(jīng)元潛在毒性的指標(biāo)，用于檢測腦神經(jīng)系統(tǒng)和評(píng)價(jià)腦的早期發(fā)育。在神經(jīng)毒性研究領(lǐng)域，斑馬魚與哺乳動(dòng)物模型一樣，可以借助生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)、行為學(xué)來評(píng)價(jià)藥物的神經(jīng)毒性，檢測斑馬魚腦部神經(jīng)元的壞死和凋亡情況；未來，斑馬魚在神經(jīng)學(xué)方面，將具有更加重要的研究價(jià)值[2-4]（圖1）。

1.3 心臟發(fā)育及心血管方面的應(yīng)用

斑馬魚的胎心類似于人類胚胎的心臟，分為心房和心室，房室之間有瓣膜，因而為研究人類心血管系統(tǒng)提供了一類較好的模型。而且，斑馬魚的卵體透明、胚胎發(fā)育快、心臟體節(jié)清晰，早期發(fā)育存活不依賴于血液循環(huán)，可用肉眼直接觀察活魚卵心臟的明顯形態(tài)和功能缺陷，或通過分子標(biāo)記物來識(shí)別細(xì)微差別。受精48 小時(shí)后，發(fā)育正常的的斑馬魚胚胎，即可用于心臟毒性研究。斑馬魚在心血管藥物氯氮平、紅霉素、奎尼丁、阿司咪唑等評(píng)價(jià)方面都有所研究。Zhang等對(duì)斑馬魚心臟復(fù)蘇進(jìn)行了研究報(bào)道[5]。一些藥物可導(dǎo)致斑馬魚心包水腫、心臟畸形、心率減低，體長縮短、體節(jié)發(fā)育異常、脊柱彎曲、卵黃囊水腫、出血、心臟縮小等多種表型改變。

1.4 斑馬魚評(píng)價(jià)骨骼發(fā)育毒性效應(yīng)

硬骨魚發(fā)育中的基因、信號(hào)通路和人類骨骼發(fā)育具有高度同源性，相對(duì)于其他模型動(dòng)物，斑馬魚具備個(gè)體小、繁殖快、適合高通量篩選、身體透明、易于觀察骨骼發(fā)育等優(yōu)勢。近年來，以斑馬魚為模型的骨骼研究逐漸成為熱點(diǎn)，其中，中藥治療骨質(zhì)疏松的功效正日益受到重視，但壯骨中藥及其成分，特別是量微成分的活性評(píng)價(jià)卻難以有效開展。新模型、新方法的建立有益于豐富中藥壯骨效應(yīng)評(píng)價(jià)的思路與方法。模式生物斑馬魚既是一類較好的、熱門的藥學(xué)研究工具，根據(jù)其骨骼發(fā)育的生理、遺傳學(xué)特點(diǎn)和優(yōu)勢，將斑馬魚用于中藥復(fù)雜體系及成分的壯骨效應(yīng)評(píng)價(jià)，具有合理性和可行性。

2 病理毒理學(xué)中的應(yīng)用

2.1 斑馬魚評(píng)價(jià)感官毒理學(xué)效應(yīng)

斑馬魚的卵受精 72 小時(shí)后，視網(wǎng)膜已與成魚相似，而且幼魚眼睛占身體的很大部分，操作極其方便，斑馬魚特別適用于眼部疾病的研究。一旦其視力受損，斑馬魚會(huì)經(jīng)常生活在暗處，皮膚的色素沉積黑素體隨之增加，通過眼睛大小或皮膚上的色素沉積可以方便快速地篩選出有視覺缺陷的斑馬魚。目前，發(fā)現(xiàn)的斑馬魚眼部特異性細(xì)胞或?qū)訐p傷突變體已超過 50 種，視功能和眼球運(yùn)動(dòng)的有關(guān)試驗(yàn)還在進(jìn)行中[6]。

在斑馬魚模型中，耳的生長發(fā)育和功能、味蕾的細(xì)胞分子機(jī)制研究相對(duì)較少，但也都在展開進(jìn)一步的研究。斑馬魚的聽覺器官由耳囊及附屬結(jié)構(gòu)（如毛細(xì)胞和半規(guī)管）組成。斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞損傷可作為檢測耳毒性的一個(gè)重要指標(biāo)，輔以斑馬魚幼體的游泳姿態(tài)和體位指標(biāo)，可以對(duì)藥物的耳毒性進(jìn)行快速、簡便的毒性篩選。

2.2 免疫系統(tǒng)方面研究

斑馬魚的免疫系統(tǒng)與高等脊椎動(dòng)物相比，既有共性又有特殊性，近年來，斑馬魚在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究逐漸被人們所重視[7-8]。哺乳動(dòng)物中，骨髓和胸腺屬于中樞免疫器官，外周免疫器官有脾和淋巴結(jié)；而斑馬魚的腎是生成免疫細(xì)胞的主要器官，類似于人類的骨髓，在其中發(fā)現(xiàn)有T細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞。采用基因芯片技術(shù)篩選與魚類皮膚免疫相關(guān)的功能基因，將有助于魚類皮膚局部免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究（圖2）。

2.3 內(nèi)分泌系統(tǒng)研究

內(nèi)分泌干擾物廣泛存在于水環(huán)境中，能夠使脊椎動(dòng)物的發(fā)育、生理自身調(diào)節(jié)和健康狀況發(fā)生改變，引起了環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前常采用VTG誘導(dǎo)這一內(nèi)分泌干擾研究方式，廣泛篩選潛在影響內(nèi)分泌通路的污染物，則需要轉(zhuǎn)錄組方法、組織病理學(xué)方法。性激素、生長激素、損傷修復(fù)酶系等在斑馬魚生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用；內(nèi)分泌擾亂物質(zhì)對(duì)其生長發(fā)育影響的研究，主要集中于其對(duì)性激素的影響。目前，在激素水平研究內(nèi)分泌生理和毒理存在一定難度，主要因?yàn)殡y以采集足量的測定血液，整體的激素檢測技術(shù)還不成熟。

3 斑馬魚的生態(tài)毒理學(xué)研究

3.1 在常規(guī)毒性試驗(yàn)中的應(yīng)用

我國制定了關(guān)于水質(zhì)的毒性實(shí)驗(yàn)方法，用于衡量水中單一化學(xué)物質(zhì)或工業(yè)廢水的毒性。采用半靜態(tài)法測定了 360 種常用農(nóng)藥制劑對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明：近一半的制劑對(duì)斑馬魚表現(xiàn)高毒或劇毒效應(yīng)，涉及 25 種農(nóng)藥的有效成分，主要為殺蟲劑，毒性相遠(yuǎn)高于殺菌劑和除草劑，微生物農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的毒效應(yīng)較低，而部分植物源農(nóng)藥表現(xiàn)的毒性較高；相同有效成分的不同制劑之間由于有效成分含量、劑型及加工工藝的不同，會(huì)表現(xiàn)不同的毒效應(yīng)。

3.2 在生物誘導(dǎo)效應(yīng)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

斑馬魚胚胎常被用于生物誘導(dǎo)方面的研究。誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)有脊椎形態(tài)異常、體節(jié)減少、心臟血液系統(tǒng)異常、鰓弓及腭發(fā)育異常、 腦和神經(jīng)系統(tǒng)退化、魚鰭發(fā)育不全和魚鰾缺失等現(xiàn)象，其中以脊柱和體節(jié)異常為主。也可以利用斑馬魚對(duì)生物誘導(dǎo)劑的敏感作用，檢測水環(huán)境中的生物誘導(dǎo)劑。用腺苷二磷酸誘導(dǎo)斑馬魚血小板，發(fā)現(xiàn)腺苷二磷酸能使斑馬仔魚血小板在其眼睛、背部等處聚集，一定條件時(shí)可導(dǎo)致其死亡（圖3）。

3.3 斑馬魚評(píng)價(jià)納米粒子毒性

納米科技是 21 世紀(jì)的重點(diǎn)發(fā)展領(lǐng)域之一，目前，納米粒子的生物安全性體外實(shí)驗(yàn)已取得了一些研究成果，但其體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)，由于各種限制而進(jìn)展緩慢。斑馬魚是納米粒子活體生物安全性評(píng)價(jià)的最佳模式動(dòng)物。Patrick Lie Johansen等借助光學(xué)系統(tǒng)和透明斑馬魚/胚胎研究了活體中納米粒子/細(xì)菌和細(xì)胞間的相互作用，構(gòu)建了新型的研究平臺(tái)和手段，為未來腫瘤診療、腫瘤組織損壞和生物感染研究，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[10]。

4 結(jié)論與展望

斑馬魚作為脊椎動(dòng)物，與人類基因的相似度高達(dá)87%，具有哺乳動(dòng)物相似的心血管、造血、神經(jīng)、代謝等系統(tǒng)，在遺傳、生理和藥理反應(yīng)方面也與人類存在高度的相似性，基因和化學(xué)篩選證明，斑馬魚可以高度模擬人類和其他生物體。

斑馬魚在活體研究領(lǐng)域?qū)⑵鸬皆絹碓街匾淖饔?，包括藥物篩選和藥效評(píng)價(jià)、水環(huán)境毒理學(xué)、食品科學(xué)、疾病甄治、腦神經(jīng)科學(xué)、器官再生、細(xì)胞遷移、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、分子生物學(xué)、社會(huì)學(xué)、行為學(xué)等方面。我們相信，我國斑馬魚領(lǐng)域?qū)⒌玫娇焖侔l(fā)展，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏訌V泛，重大成果將更多涌現(xiàn)，為世界生命科學(xué)發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Yuma O.； Thomas N.S. Whole-mount single molecule FISH method for zebrafish embryo[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8571|DOI： 10.1038/srep08571.

[2]Chen S.J.； Chiu C.N.； McArthur K.L.； et al. TRP channel mediated neuronal activation and ablation in freely behaving zebrafish[J]. Nature Methods， 2016， 13（2）： 147-152.

[3]Randlett O.； Wee C.L.； Naumann E.A.； et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas[J]. Nature Methods， 2015， 12（11）： 1039-1050.

[4]Andersson M.A.； Fredrik E.； Roger O. Using visual lateralization to model learning and memory in zebrafish larvae[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8667|DOI： 10.1038/srep08667.

[5]Zhang R.l.； Han P.D.； Yang H.B.； et al. In vivo cardiac reprogramming contributes to zebrafish heart regeneration[J]. Nature Letter， 2013， 498： 497-502.

[6]Affaticati P.； Yamamoto K.； Rizzi B.； et al. Identification of the optic recess region as a morphogenetic entity in the zebrafish forebrain[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8738|DOI： 10.1038 /srep08738.

[7]Tang Q.； Moore J.C.； Ignatiu M.S.； et al. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immunedeficient zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10358|DOI： 10.1038/ncomms10358.

[8]Kaufman C.K.； Mosimann C.； Fan Z.P.； et al. A zebrafish melanoma model reveals emergence of neural crest identity during melanoma initiation[J]. Science， 2016， 351（6272）， （aad2197） 1-10.

[9]Jank T.； Eckerle S.； Steinemann M.； et al. Tyrosine glycosylation of Rho by Yersinia toxin impairs blastomere cell behaviour in zebrafish embryos[J]. Nature Communications， 2015， 6：7807|DOI： 10.1038/ncomms8807.

[10]Patrick L.J.； Federico F.； Lasse E.； et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish[J]. Nature Communications， 2016， 7：10974|DOI： 10.1038/ncomms10974.

[責(zé)任編輯：楊玉潔]