黃昱昊　何敏彤　楊圳沖　廖智恒　許衍揚　李夢圓　柳嘉欣　顧懷宇

納米金顆粒對大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)的影響

黃昱昊何敏彤楊圳沖廖智恒許衍揚李夢圓柳嘉欣顧懷宇

510080 廣州，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

【摘要】目的觀察頸靜脈注射納米金顆粒對大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)的影響。方法經(jīng)頸靜脈向大鼠注射50 nm金顆粒。分別在1、2、3、4、5、6 h時收集大鼠腦脊液，采用電感偶合等離子體質(zhì)譜儀檢測腦脊液納米金顆粒濃度。在注射納米金顆粒6 h后取腦組織并固定制片，在透射電鏡下觀察納米金顆粒及腦組織的超微結(jié)構(gòu)；大鼠腦組織制作切片后經(jīng)普魯士藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色，在光鏡下觀察大鼠血腦屏障的出血情況和完整性。結(jié)果大鼠腦脊液中納米金顆粒濃度隨時間延長逐漸升高，并在3 h后趨于穩(wěn)定；電鏡下可見大鼠腦細(xì)胞布滿納米金顆粒，超顯微結(jié)構(gòu)有一定改變；光鏡下，大鼠血腦屏障在普魯士藍(lán)染色后可見出血點，在免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色后可見血管缺損。結(jié)論納米金顆?？赏高^血腦屏障并造成微小出血點及血管微小缺損。

【關(guān)鍵詞】納米顆粒；血腦屏障；大鼠；透射電鏡

近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為國內(nèi)外的研究熱點，例如癲癇、帕金森綜合征、阿爾茨海默病等。但大部分藥物由于不能透過血腦屏障到達(dá)靶標(biāo)，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療成為難點。雖然血腦屏障有效阻擋了毒物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使其保持相對穩(wěn)定，但同時也阻礙了藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮藥效[1-2]。納米材料作為藥物載體，不僅可與多種藥物結(jié)合透過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且可精確控制藥物釋放時間和空間[3-4]。納米技術(shù)將會廣泛運用于臨床，但其作用機(jī)制和安全性仍未完全闡明。為此，本研究予大鼠注射納米金顆粒，并對其血腦屏障的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行一系列的觀察，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實驗動物及分組

16只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～250 g，購于廣東醫(yī)學(xué)動物實驗中心。將大鼠分為實驗組和對照組，每組各8只，遵循中山大學(xué)實驗室動物管理規(guī)范飼養(yǎng)，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

二、主要藥品和試劑

包括50 nm金顆粒(中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心)、Claudin-5多克隆抗體(美國Sigma公司)、免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

三、實驗方法

1. 納米金顆粒解聚

將納米金顆粒懸液用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至0.5 mg/ml，振蕩，然后用數(shù)控超聲波儀在功率300 W、水溫25～30℃時超聲解聚3次，每次10 min。

2. 給藥方法

用異氟醚麻醉大鼠后，在解剖放大鏡下小心暴露大鼠頸靜脈，用血管鉗夾閉頸靜脈近心端血流，在頸靜脈遠(yuǎn)心端做一個V形切口后插入插管。實驗組和對照組通過頸靜脈插管分別注射0.5 mg/ml的納米金顆粒溶液5 mg/kg和等體積的PBS溶液。

3. 大鼠腦脊液抽取

用異氟醚麻醉大鼠后，在解剖放大鏡下在大鼠第二骶椎處做一正中縱向切口，小心分離肌肉暴露第二骶椎并用鑷子將其掀開，暴露硬脊膜。在硬脊膜上作一V形切口，將馬尾套管插入蛛網(wǎng)膜下隙，腦脊液即可從管中流出并連續(xù)收集，將套管扎緊并固定于皮膚。在納米金顆粒注射1、2、3、4、5、6 h時收集腦脊液標(biāo)本。

4. 納米金顆粒的檢測

將收集的腦脊液通過電感等離子體發(fā)射光譜儀[5](ICP-MS，Perkin-Elmer，USA)測定其納米金顆粒濃度，由國家納米科學(xué)中心完成。

5. 腦組織取材

在注射納米金顆粒6 h后，注射甲苯噻嗪和氯胺酮(0.011、0.2 mg/kg)麻醉，經(jīng)冠狀動脈用生理鹽水灌流處死后，取腦組織置入4%戊二醛固定液在4℃下固定過夜。

6. 電鏡樣本的制備

將固定的樣本以0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次30 min；后用1%四氧化鋨固定1 h，統(tǒng)一方法沖洗3次；丙酮系列脫水，丙酮∶包埋劑Epon812環(huán)氧樹脂(1∶1和1∶2)與純包埋劑系列滲透，包埋聚合；超薄切片，經(jīng)鈾鉛雙重染色；在電子顯微鏡下觀察[6]。

7. 普魯士藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色

將已固定好的腦組織行冠狀面切片，厚40 μm。對于每例腦組織標(biāo)本每逢第6片共12片作普魯士藍(lán)染色[7]。每逢第2片共10片作免疫組織化學(xué)染色[8]。每逢第4片共10片作免疫熒光染色。

在普魯士藍(lán)染色實驗中，將組織切片脫蠟至蒸餾水；普魯士藍(lán)染液染色20 min，蒸餾水沖洗；1%伊紅對比染色 1 min，蒸餾水沖洗； 95%乙醇至無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

在免疫組織化學(xué)染色實驗中，將組織切片行過氧化物酶阻斷，正常山羊血清封閉，滴加50 μl鼠抗Claudin-5(1∶100)。4℃孵育過夜后，滴加即用型生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG，室溫孵育15 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，顯色后蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染、脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

在免疫熒光染色實驗中，將組織切片用5%驢血清封閉30 min，勿洗；滴加鼠抗Claudin-5(1∶100)，4℃孵育過夜；用PBS沖洗后，滴加驢抗鼠熒光二抗(1∶100)，室溫下避光孵育1 h；甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、腦脊液中納米金顆粒的形態(tài)及濃度

納米金顆粒懸液經(jīng)充分解聚后，透射電鏡下觀察可見，納米金顆粒的直徑在40～50 nm之間，顆粒分散良好，呈圓球狀，見圖1。實驗組在1、2、3、4、5、6 h腦脊液中納米金顆粒濃度依次為(53±4)、(60±5)、(86±3)、(94±4)、(86±5)、(100±8)μg/L，1 h和2 h、4 h和5 h、5 h和6 h、3 h和5 h、3 h和6 h、4 h和6 h間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為0.366、2.776、0.190、4.329、1.840、4.329、P均>0.003)，2 h和3 h、3 h和4 h、1 h和3 h、2 h和4 h、2 h和6 h、1 h和4 h、1 h和5 h、1 h和6 h、2 h和6 h間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為11.598、9.887、5.085、14.429、27.524、4.632、6.002、9.226、19.750、P均<0.003)。大鼠腦脊液中納米金顆粒濃度隨時間延長逐漸升高，并在3 h后趨于穩(wěn)定。對照組中腦脊液的納米金顆粒濃度均為0。

圖1　腦脊液中納米金顆粒的形態(tài)及濃度

A：50 nm金顆粒掃描電鏡圖(×50 000)；B：腦脊液中納米金顆粒濃度隨時間延長的變化情況

二、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)改變

電子顯微鏡下，對照組細(xì)胞核仁清晰，核膜完整，染色質(zhì)均勻，線粒體無腫脹，線粒體嵴結(jié)構(gòu)正常；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常；無納米金顆粒的存在[9]。實驗組細(xì)胞核電子密度較低，核周間隙變寬，線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。在脈絡(luò)叢、大腦皮質(zhì)和海馬電鏡圖中均出現(xiàn)大量黑色圓點，直徑約為50 nm，為納米金顆粒，見圖2。

圖2　電子顯微鏡下大鼠脈絡(luò)叢、腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的超微結(jié)構(gòu)

A、B、C：對照組(×10 000)；D、E、F：實驗組(×20 000)；A、D脈絡(luò)叢；B、E：大腦皮質(zhì)；C、F：海馬；紅色箭頭：納米金顆粒

三、普魯士藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色結(jié)果

在顯微鏡下，實驗組大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)和小腦的組織切片中均可觀察到普魯士藍(lán)染色陽性的斑塊，但數(shù)目不多，僅有2～3處；而在對照組切片中均未觀察到普魯士藍(lán)染色陽性斑塊。正常對照組大鼠Claudin-5在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞間表達(dá)強烈清晰呈連續(xù)條帶狀分布。實驗組大鼠的Claudin-5表達(dá)水平下降，小血管的緊密連接出現(xiàn)缺損，見圖3。

圖3　大鼠腦組織普魯士藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色結(jié)果

A、C、E：對照組(×200)；B、D、F：實驗組(B×100,D、F×200)；A、B：普魯士藍(lán)染色切片，箭頭所指為出血點；C、D：免疫組織化學(xué)染色切片箭頭所指為Claudin-5表達(dá)減少及血管破損處；E、F：免疫熒光染色切片，箭頭所指為Claudin-5表達(dá)減少及血管破損處

討論

近年隨著納米材料的發(fā)展，納米材料作為藥物載體運用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究也越來越多。納米材料作為診斷和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的重要途徑，能否通過血腦屏障以及會否對其結(jié)構(gòu)或功能造成損害，是研發(fā)納米材料作為診斷或治療手段的一大瓶頸[2]。

廣義的血腦屏障包括血-腦組織屏障和血-腦脊液屏障，由血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間緊密連接、內(nèi)皮基膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞終足組成，它是血液循環(huán)和腦區(qū)之間的屏障，嚴(yán)格控制物質(zhì)的進(jìn)出，有效抵御血液循環(huán)中有害物質(zhì)進(jìn)入腦區(qū)，同時也限制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物的進(jìn)出。本研究一方面運用頸靜脈注射給藥，并實時抽取腦脊液結(jié)合電感偶合等離子體質(zhì)譜分析腦脊液中納米金顆粒濃度的方法，另一方面將腦組織固定后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色、免疫組組化學(xué)和免疫熒光染色以及電鏡制片，研究納米金顆粒在血腦屏障的透過性。結(jié)果顯示，當(dāng)納米金顆粒通過血腦屏障時，可在腦脊液及腦細(xì)胞中檢測到納米金顆粒，納米金顆粒濃度逐漸升高，3 h后趨于穩(wěn)定。推測是由于納米金顆粒在靜脈注射后逐漸在腦脊液中累積，而后金顆粒進(jìn)出血-腦脊液屏障趨于穩(wěn)定而使?jié)舛染S持在一定范圍內(nèi)。

脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的完整性是血-腦脊液屏障完整性的重要標(biāo)志之一，而大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。本研究顯示，在脈絡(luò)叢切片中，納米金顆粒在上皮細(xì)胞纖毛上的微絨毛聚集，由此推測納米金顆?？赡苁峭ㄟ^脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的纖毛進(jìn)入血-腦脊液屏障的。在大腦皮質(zhì)和海馬切片中可見納米金顆粒聚集于細(xì)胞內(nèi)，其中大腦皮質(zhì)以細(xì)胞核中為多，由此推測納米金顆?？赏高^血-腦組織屏障。在電鏡下，腦組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)有一定的改變，說明細(xì)胞代謝過程發(fā)生改變，但改變細(xì)微，是否影響功能應(yīng)進(jìn)一步探究。當(dāng)紅細(xì)胞破壞時，血紅蛋白被氧化為含鐵血黃素后可被普魯士藍(lán)染成藍(lán)色。故推測在藍(lán)色斑塊處存在血管破損點，紅細(xì)胞經(jīng)破損處擠壓被破壞并聚集在破損處而呈藍(lán)色。腦血管的破損可能是由于納米金顆粒通過血腦屏障時造成的，但數(shù)目不多，其他腦組織結(jié)構(gòu)無明顯異常。Claudin-5是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中的特異性蛋白，可作為血腦屏障完整的標(biāo)志[10]。經(jīng)抗體標(biāo)記后，在光鏡下可見血腦屏障出現(xiàn)微小缺損，這些缺損可能是由于金顆粒通過血腦屏障時造成的。雖然納米金顆粒穿過血腦屏障時破壞了其結(jié)構(gòu)并造成了出血，但破損處的數(shù)目少且出血點小，而且除血腦屏障的組成成分受到損傷，其余腦組織結(jié)構(gòu)無明顯變化。有關(guān)大鼠血腦屏障的功能是否受到納米金顆粒的影響尚需進(jìn)一步研究。

將納米金顆粒經(jīng)頸靜脈注射后，納米金顆粒在透過血腦屏障的同時，使部分腦細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，造成血腦屏障的微出血和微損傷。據(jù)此推測，納米金顆粒進(jìn)入血腦屏障的機(jī)制可能是通過破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)使其屏障功能障礙而增加血腦屏障對納米金顆粒的透過性[11]。雖然納米金顆粒對血腦屏障的結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷，但損傷較為微小且數(shù)量較少，在實驗過程中大鼠的生命體征無明顯改變。在進(jìn)一步研究中，我們將在大鼠注射納米金顆粒后檢測血腦屏障的功能改變以及觀察大鼠的長期行為學(xué)變化。

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Effect of Au nanoparticles on the blood-brain barrier of rats

HuangYuhao,HeMintong,YangZhenchong,LiaoZhiheng,XuYanyang,LiMengyuan,LiuJiaxin,GuHuaiyu.

DepartmentofAnatomy,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect on the structure of blood-brain barrier after the intravenous administration of Au nanoparticles to the rats. Methods 50 nm Au nanoparticles were intravenous administrated into rats through jugular vein. CSF was then collected with a cauda equine catheterization technique at 1, 2, 3, 4, 5 and 6 hours respectively after the administration. And the concentration of Au was detected by ICP-MS analysis. After injection the nanoparticles of 6 hours, the brains of the rats were collected and stored as fixed films, and then to observe the nanoparticles and ultrastructure of brain tissue under the TEM. Other samples were stained by Prussian blue dye, Immunohistochemistry and Immunofluorescence and observed bleeding and integrity of the blood-brain barrier under microscope after making slices of brain tissue in rats. ResultsThe concentration of Au nanoparticles in CSF gradually increased and stabilized after 3 hours. Under TEM, a large amount of Au nanoparticles appeared in the brain tissue and there were some changes of the ultrastructure of the brain tissue. Under microscope, there were hemorrhages after blood-brain barrier in rats were stained by Prussian blue-positive dye and some brain blood vessels were damaged in the Immunofluorescence and Immunohistochemistry staining slice. ConclusionAu nanoparticles are able to permeate the brain-blood barrier and cause micro bleedings and micro damages of brain vessel.

【Key words】Nanoparticles; Blood-brain barrier; Rat; Transmission electron

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.003

基金項目：廣東省科技計劃項目(2012B090600019)

通訊作者，顧懷宇，E-mail：gu_huaiyu@yahoo.com

Corresponding author, Gu Huaiyu, E-mail: gu_huaiyu@yahoo.com

(收稿日期：2016-03-25)(本文編輯：林燕薇)

·基礎(chǔ)研究論著·

共同第一作者，何敏彤