周媛 童俊 毛靜 徐冬云 方林川 董艷芳 劉義滿 郭彩霞 譚慶 楊俊娟 祝安新

摘要：以胭脂蜜（Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi）、花蝴蝶（Rhododendron obtusum cv. Huahudie）和西施（Rhododendron obtusum cv. Xishi）3個杜鵑品種為研究試材，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)采用盆栽控水法進行干旱脅迫處理，利用透射電鏡觀測葉片細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，杜鵑葉片葉綠體和線粒體都隨干旱脅迫的程度加深而受到損壞，葉綠體對于水分的虧缺較線粒體更加敏感。對于抗旱性較強的胭脂蜜，質(zhì)壁分離出現(xiàn)更晚，葉綠體和線粒體的損傷程度更輕，葉片細胞結(jié)構(gòu)對于杜鵑抗旱性強弱的決定作用較大。

關(guān)鍵詞：杜鵑;干旱脅迫;抗旱性;超微結(jié)構(gòu);透射電鏡

中圖分類號：S685.21 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0136-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.033 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Effect of drought stress on leaf ultrastructure of Rhododendron L.

ZHOU Yuan1，TONG Jun1，MAO Jing1，XU Dong-yun1，F(xiàn)ANG Lin-chuan1，DONG Yan-fang1，

LIU Yi-man1，GUO Cai-xia2，TAN Qing2，YANG Jun-juan3，ZHU An-xin3

（1.Institute of Forestry & Fruit-tree，Wuhan Academy of Agricultural Sciences/Hubei Engineering Technology Research Center of Landscape Plant，Wuhan 430075，China;2.Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430065，China;3.Jiangxia Forestry Science and Technology Promotion Station，Wuhan 430000，China）

Abstract： Using transmission electron microscope， the leaf ultrastructure were investigated in Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi， Rhododendron obtusum cv. Huahudie and Rhododendron obtusum cv. Xishi under drought stress in light incubator. The results showed that the damage of mitochondria and chloroplast increased as the drought degree increased， and chloroplast was more sensitive than mitochondria to the external environment. The plasmolysis appeared later in Rhododendron obtusum ‘Yanzhimi with relatively highest drought resistance. In which， the chloroplast and mitochondria were less damaged. There was an important association between leaf cell structure and drought resistance in Rhododendron L..

Key words： Rhododendron L.; drought stress; drought resistance; ultrastructure; transmission electron microscope （TEM）

杜鵑（Rhododendron L.）是對杜鵑花科杜鵑花屬植物的總稱。杜鵑因花色豐富，開花時花朵繁密，綺麗多姿，在眾多園林植物中享有獨特的地位，被列入“世界三大園林植物”“中國三大天然名花”，同時是中國十大傳統(tǒng)名花之一，享有“木本花卉之王”的美譽，是世界著名的觀賞花卉，有極高的園林應(yīng)用價值、經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。但國內(nèi)杜鵑應(yīng)用主要以盆景盆花為主，在園林綠化方面市場應(yīng)用品種極少，主要品種僅1～2種，花量少，花型簡單，且花色單一，綜合觀賞價值較差，常用作綠籬而非花籬種植。中國目前正在大力發(fā)展園林城市，重視城市環(huán)境的綠化和美化，花卉產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，市場對杜鵑的需求越來越大，雖然國內(nèi)擁有著豐富的杜鵑資源，但開發(fā)利用的品種較少。城市綠化中通常面臨最嚴重的問題是干旱，即使在南方地區(qū)也存在季節(jié)性缺水，加之目前園林管理養(yǎng)護能力較低，造成杜鵑在城市園林中的應(yīng)用受到很大程度的限制，干旱對杜鵑的傷害是杜鵑應(yīng)用中亟待解決的問題。對具較高觀賞價值、較強抗旱能力和適應(yīng)能力的杜鵑進行抗旱機制的研究，開發(fā)培育更耐旱的杜鵑品種，實現(xiàn)生物節(jié)水，是推廣杜鵑園林綠化應(yīng)用的一種有效方式。

對干旱脅迫下杜鵑葉片超微結(jié)構(gòu)變化開展了研究，從細胞學角度探討不同杜鵑品種對干旱脅迫響應(yīng)的差異，豐富杜鵑抗旱研究內(nèi)容，為后期的抗旱分子機制研究奠定基礎(chǔ)，為選育抗旱性較強的杜鵑優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。有助于充分利用國內(nèi)豐富的杜鵑資源，開展引種、馴化等工作，使杜鵑在城市園林綠化中得到更廣泛的應(yīng)用。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗于武漢市農(nóng)業(yè)科學院林業(yè)果樹科學研究所實驗室進行，供試品種為胭脂蜜（Rhododendron obtusum cv. Yanzhimi）、花蝴蝶（Rhododendron obtusum cv. Huahudie）和西施（Rhododendron obtusum cv. Xishi）。選擇3個品種長勢良好、株形一致、無病蟲害的3年生扦插盆栽苗為試驗材料。前期干旱試驗觀測結(jié)果表明，不同品種抗旱性為胭脂蜜>西施>花蝴蝶。

1.2 ?方法

將3個杜鵑品種（胭脂蜜、花蝴蝶、西施）盆栽苗放置于光照培養(yǎng)箱中進行干旱脅迫處理，光照培養(yǎng)箱設(shè)置條件為溫度25 ℃，每天光照12 h;干旱處理為先給盆栽苗澆清水至飽和，以后不再澆水，以12 d為1個處理周期。分別在進行干旱脅迫0、3、6、9、12 d進行葉片樣品收集制備，以0 d取的樣品作為對照。

取相同位置上杜鵑成熟功能葉片，避開主脈，在中脈至葉邊緣1/2處取約1 mm×1 mm大小的葉片小塊，迅速投入到2.5%戊二醛固定液中，抽氣30 min，使葉片全部浸泡在固定液中，室溫放置2 h，置于4 ℃冰箱保存，制備常規(guī)透射電鏡樣品，每個品種每次取樣50個重復。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?干旱脅迫對杜鵑葉肉細胞整體形態(tài)的影響

干旱脅迫條件下，杜鵑的細胞整體形態(tài)都受到了不同程度的影響（圖1）。干旱脅迫0 d（圖1a、圖1f、圖1k），3個品種的細胞總體形態(tài)無較大差異，細胞形態(tài)規(guī)則，細胞器均沿細胞壁分布，細胞膜完整，胞間連絲清晰可見。胭脂蜜進行干旱脅迫6 d內(nèi)（圖1a、圖1b、圖1c），細胞形態(tài)未發(fā)生較大變化，9 d（圖1d）時細胞整體形態(tài)開始變形，細胞器有向細胞中心移動的趨勢，細胞膜仍完整，但已出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，12 d（圖1e）時細胞質(zhì)壁分離嚴重，且細胞膜已破裂，細胞器散落于細胞中央，細胞壁仍保持完整?；ê珊得{迫3 d（圖1g），細胞依然緊密排列，6 d（圖1h）時已開始變形，形態(tài)較扭曲，出現(xiàn)質(zhì)壁分離，細胞器趨向細胞中央移動，干旱脅迫9 d（圖1i）時出現(xiàn)嚴重的質(zhì)壁分離，細胞膜破裂但細胞壁完整，12 d（圖1j）時細胞壁已破碎，整個細胞解體，細胞器外流出細胞。西施在整個干旱過程中都觀察到較大的淀粉粒（圖1k至圖1o），干旱脅迫3 d（圖1l）細胞開始變形，部分細胞出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離，細胞器趨向于向細胞中央移動，6 d（圖1m）時出現(xiàn)嚴重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，部分細胞細胞膜已破裂，細胞器散落于細胞中央，細胞壁外部出現(xiàn)不規(guī)則或泡狀的膨脹，干旱脅迫9 d（圖1n）細胞膜完全破裂，細胞器聚集于一起偏離中央位置而靠于細胞壁一側(cè)，細胞壁仍保持完整，12 d（圖1o）時細胞器相互粘連，基本連成一片，難以區(qū)別辨認，細胞壁破裂，細胞內(nèi)含物向外流出。

2.2 ?干旱脅迫對杜鵑葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

干旱脅迫條件下，杜鵑的葉綠體組織結(jié)構(gòu)受到了不同程度的影響（圖2）。葉綠體的形狀發(fā)生改變，由原來的梭形或長橢圓形膨脹呈近球形或不規(guī)則形狀，在嚴重的干旱脅迫情況下產(chǎn)生破碎。隨著干旱脅迫加深，各品種杜鵑葉片葉綠體均由原先的緊貼細胞壁排列，逐漸向細胞中央移動。干旱脅迫0 d，3個品種的葉綠體總體形態(tài)無較大差異（圖2a、圖2f、圖2k），其中胭脂蜜（圖2a）葉綠體周圍有類似晶體的物質(zhì)，晶體長條狀，形態(tài)規(guī)則，緊貼葉綠體分布。干旱脅迫3 d，胭脂蜜葉綠體形態(tài)無較大變化，花蝴蝶（圖2g）與西施（圖2l）葉綠體不再緊貼細胞壁，且葉綠體外膜變得模糊，基粒片層較胭脂蜜（圖2b）紊亂，出現(xiàn)少量嗜鋨顆粒。6 d時胭脂蜜（圖2c）仍能觀察到完整的葉綠體結(jié)構(gòu)與清晰的片層結(jié)構(gòu)，同樣出現(xiàn)少許嗜鋨顆粒，類晶體的物質(zhì)形態(tài)變得模糊、雜亂;花蝴蝶（圖2h）葉綠體外膜破裂，形態(tài)膨脹;西施（圖2m）葉綠體外膜仍完整，形態(tài)膨脹呈長橢圓形，已觀察不到片層結(jié)構(gòu)，嗜鋨顆粒增多。干旱脅迫9 d，胭脂蜜（圖2d）葉綠體外膜變模糊，整體形態(tài)膨脹，嗜鋨顆粒聚集，類晶體物質(zhì)依然緊貼在葉綠體附近，但已形態(tài)模糊;花蝴蝶（圖2i）葉綠體邊緣已破裂，膨脹呈近圓形;西施（圖2n）葉綠體外膜仍可觀察到，未完全破裂，進一步膨脹，嗜鋨顆粒聚集。干旱脅迫12 d，胭脂蜜（圖2e）葉綠體膜破裂，整體膨脹，類晶體物質(zhì)仍在葉綠體周圍散亂分布，但形態(tài)已完全無法辨認;花蝴蝶（圖2j）葉綠體膨脹呈圓形，葉綠體膜已完全解體，邊緣破碎不規(guī)則;西施（圖2o）葉綠體膨脹呈不規(guī)則狀，內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂，出現(xiàn)空腔的現(xiàn)象。

2.3 ?干旱脅迫對杜鵑線粒體結(jié)構(gòu)的影響

在干旱脅迫條件下，線粒體結(jié)構(gòu)隨干旱脅迫時間的增加而受到不同程度的影響（圖3）。進行干旱脅迫0 d，3個品種的線粒體（圖3a、圖3f、圖3k）結(jié)構(gòu)無較大差異，多為圓形或類圓形，具有雙層膜，膜結(jié)構(gòu)完整，能明顯觀察到線粒體內(nèi)部的嵴。干旱脅迫3～6 d（圖3b、圖3c、圖3g、圖3h、圖3l、圖3m），各品種的線粒體變化基本相同，形態(tài)未發(fā)生較大改變，外膜清楚，但內(nèi)膜結(jié)構(gòu)開始模糊，可以觀察到部分嵴。胭脂蜜干旱脅迫9 d（圖3d）外膜開始變模糊，內(nèi)部出現(xiàn)空洞，12 d（圖3e）時，部分線粒體保持完整，部分線粒體膜破裂，內(nèi)部物質(zhì)向外流出，出現(xiàn)空洞?；ê珊得{迫9 d（圖3i）線粒體內(nèi)部降解，外膜也破碎，輪廓模糊不清，12 d（圖3j）時在細胞中散落較多碎片，線粒體已無法辨認。西施中線粒體干旱脅迫9 d（圖3n）發(fā)生變形，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊，外膜還未完全破裂，12 d（圖3o）時在細胞內(nèi)部只能觀察到形似線粒體物質(zhì)，已無外膜包裹，內(nèi)部模糊不清，難以辨別。

3 ?小結(jié)與討論

隨著干旱脅迫程度的加重，3個杜鵑品種的葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)都受到不同程度的影響。胭脂蜜在整個干旱脅迫過程中，質(zhì)壁分離現(xiàn)象出現(xiàn)時間較其余兩個品種晚，其細胞膜受傷害程度在相同的處理時間明顯低于花蝴蝶和西施，且細胞壁至脅迫處理結(jié)束依然保持完整，而花蝴蝶與西施細胞壁都已破裂，導致干旱脅迫后期細胞器外流出細胞。這些細胞超微結(jié)構(gòu)變化與植株外觀形態(tài)表現(xiàn)一致，胭脂蜜在受到干旱脅迫時能夠較長時間維持細胞的完整性，具有更強的抗旱性。

植物在干旱脅迫下，葉片細胞的超微結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯的變化。干旱脅迫能誘導植物葉片過量產(chǎn)生超氧陰離子自由基和過氧化氫之類的活性氧，破壞了活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，活性氧水平增高，從而發(fā)生脂膜過氧化和膜蛋白的聚合作用，從而損傷植物的超微結(jié)構(gòu)[1，2]。在本研究中杜鵑葉片超微結(jié)構(gòu)干旱脅迫3 d開始有輕微損傷，主要的細胞器葉綠體與線粒體隨著干旱脅迫程度的加重受到不可逆的傷害，胭脂蜜的葉綠體結(jié)構(gòu)能更長時間保持完整，受傷害程度在相同時間內(nèi)明顯低于其余兩個品種。線粒體受傷害程度在3個品種中都表現(xiàn)出前期變化不明顯，而在干旱后期，花蝴蝶線粒體首先失去完整結(jié)構(gòu)，在細胞器中已無法辨認，其次是西施，但線粒體未觀測到破裂，而胭脂蜜有線粒體已經(jīng)破裂。由此可知，在同一品種中相同的干旱脅迫情況下，葉綠體比線粒體對干旱更為敏感，線粒體比葉綠體更長時間維持完整性。

從研究結(jié)果可知，在未進行干旱脅迫時，3種杜鵑的葉綠體和線粒體結(jié)構(gòu)無較大差異，都呈梭形或長橢圓形，緊貼細胞壁排列，隨著干旱脅迫時間的增加，葉綠體呈現(xiàn)向細胞中央移動的趨勢，并膨脹為球形或不規(guī)則形;線粒體未受到干旱影響時，多為圓形或類圓形，具有雙層膜，膜結(jié)構(gòu)完整，受到干旱脅迫后，線粒體膜破裂，內(nèi)部物質(zhì)向外流出，出現(xiàn)空洞。從時間上講，葉綠體受到干旱脅迫影響比線粒體出現(xiàn)早，這說明杜鵑葉肉細胞的葉綠體對水分虧缺的敏感高于線粒體，這與禾草的表現(xiàn)一致[2，3]。葉綠體在光合作用過程中會產(chǎn)生一些活性氧物質(zhì)，在受到干旱脅迫后，杜鵑體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧物質(zhì)不能被及時清除，自由基產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，自由基首先攻擊膜系統(tǒng)，造成膜脂過氧化產(chǎn)物含量的增加，表現(xiàn)為MDA含量的增加，隨著干旱加重，葉綠體系統(tǒng)受損也會加重，但是不同抗旱能力的植物在相同干旱條件下，葉綠體的受損程度也會不同[4，5]。在本研究中，耐旱的胭脂蜜干旱脅迫6 d才出現(xiàn)明顯的受損現(xiàn)象，而西施和花蝴蝶干旱脅迫3 d已經(jīng)表現(xiàn)出較明顯的受損。由此，可以用葉綠體結(jié)構(gòu)受損程度反映其抗旱能力。水分脅迫首先是破壞膜的透性，線粒體受到損傷也是從膜開始，嵴也受到不同程度的影響。前人的研究中[6，7]，干旱脅迫對線粒體的傷害晚于葉綠體，本研究中發(fā)現(xiàn)也是如此，這可能是因為線粒體是呼吸作用的主要場所，是為植物的生命活動提供能量，在受到干旱脅迫后，對抗干旱的過程中依然需要能量的供應(yīng)。

參考文獻：

[1] 衛(wèi) ?星，王政權(quán)，張國珍.干旱脅迫下水曲柳苗木細根線粒體的形態(tài)及活性變化[J].植物生態(tài)學報，2010，34（12）：1454-1462.

[2] 鄭敏娜，李向林，萬里強，等.水分脅迫對6種禾草葉綠體、線粒體超微結(jié)構(gòu)及光合作用的影響[J].草地學報，2009，17（5）：643-649.

[3] 許振柱，于振文，董慶裕，等.水分脅迫對冬小麥旗葉細胞質(zhì)膜及葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].作物學報，1997，23（3）：370-375.

[4] 林義章，張淑媛，朱海生.銅脅迫對小白菜葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2008，16（4）：948-951.

[5] 郁 ?慧，劉中亮，胡宏亮，等.干旱脅迫對5種植物葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].植物研究，2011，31（2）：152-158.

[6] 萬里強，石永紅，李向林，等.高溫干旱脅迫下三個多年生黑麥草品種葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化[J].草業(yè)學報，2009，18（1）：25-31.

[7] 武玉葉，李德全.土壤水分脅迫對冬小麥葉片滲透調(diào)節(jié)及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].華北農(nóng)學報，2001，16（2）：87-93.