董向楠　曹　銳　尹良紅

(暨南大學附屬第一醫(yī)院,廣州510632)

ANCA陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清AECA與臨床表現(xiàn)的關系研究

董向楠曹銳尹良紅

(暨南大學附屬第一醫(yī)院,廣州510632)

[摘要]目的：探討抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清抗內皮細胞抗體(AECA)表達情況，及其與臨床表現(xiàn)的關系。方法：選取2010年至2015年在我院治療的少免疫沉積型新月體性腎小球腎炎患者，其中ANCA陰性患者45例(觀察組)，ANCA陽性患者49例(對照組)，采用Western blot檢測各組患者血清AECA水平。結果：觀察組平均年齡和伯明翰血管炎活動性評分(BVAS)分別為(41.08±9.43)歲和(15.03±3.82)分，明顯低于對照組(P<0.05)；觀察組出現(xiàn)發(fā)熱、關節(jié)痛的比例分別為26.67%和13.33%，明顯低于對照組(P<0.05)；觀察組出現(xiàn)腎病綜合征比例為48.89%，高于對照組(P<0.05)；觀察組血清AECA陽性率為46.67%，明顯低于對照組的81.63%(P<0.05)；觀察組IgG-AECA共識別7種蛋白，而對照組共識別11種蛋白，其中觀察組抗90 kD抗體陽性率為13.33%(6/45)，明顯低于對照組的51.02%(25/49)(P<0.05)；觀察組抗76 kD抗體陽性患者出現(xiàn)皮疹的比例為100%，明顯高于陰性患者(P<0.05)，抗200 kD抗體陽性患者BVAS評分為(18.02±2.51)分，明顯高于陰性患者(P<0.05)。結論：ANCA陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清存在不同的AECA,可能與某些臨床表現(xiàn)有關；ANCA陰性和陽性患者AECA有所不同，兩者臨床表現(xiàn)的差異可能與AECA的不同有關，需待進一步研究。

[關鍵詞]ANCN；AECA；少免疫沉積型；新月體腎炎

少免疫沉積型新月體腎炎(PICGN)是新月體腎小球腎炎(CGN)的一種，是一組以血尿、蛋白尿和進行性腎功能減退為主要特征的臨床綜合征[1]。目前研究主要集中在血清中抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)呈陽性的患者，但是部分PICGN患者血清ANCA呈陰性,對于這部分病例的研究較少。經研究表明抗內皮細胞抗體(AECA)在陽性PICGN發(fā)病中起到重要作用[2，3]，因此筆者推測AECA在陰性PICGN發(fā)病中也會起到一定作用。為研究AECA與陰性PICGN的關系，本次實驗就抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清抗內皮細胞抗體(AECA)表達情況，及其與臨床表現(xiàn)的關系進行探討。

1資料與方法

1.1一般資料選取2010年至2015年在我院治療的少免疫沉積型新月體性腎小球腎炎患者，納入標準：①符合新月體性腎小球腎炎的診斷標準，即腎活檢光鏡檢查超過50%的腎小球有大新月體(新月體占腎小球囊腔≥50%)形成；②腎臟直接免疫熒光病理中IgG、IgA和IgM熒光強度≤1+(0～4+分級)；③臨床病理資料保存完整；④患者知情同意，并簽署同意書。排除標準:研究開始前已行免疫抑制治療；臨床病理治療欠缺。本次研究共納入患者84例，其中抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)陰性患者35例(觀察組)，ANCA陽性患者49例(對照組)。

1.2方法

1.2.1ANCA檢測84例患者于空腹狀態(tài)下抽取3 ml靜脈血，靜置后以3 000 r/min 離心3 min取血清。采用間接免疫熒光法(IF)和 MPO、PR3 抗原特異性 ELISA 法同時檢測ANCA，試劑盒購自德國EUROIMMUN 公司。

1.2.2AECA檢測

1.2.2.1蛋白樣品收集所有患者于清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血，離心制備血清，臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)體外培養(yǎng)后[4]，加1 ml的裂解液，勻漿后12 000 r/min離心，4℃，40 min，傾倒上清液，加入0.5 ml loading buffer，直接上樣，分別加入標準品8 μl,抗原液400 μl。

1.2.2.2電泳所有蛋白樣品調至等濃度后上樣電泳(10%SDS-PAGE凝膠)，電壓120 V，進行2 h。

1.2.2.3轉膜將NC膜放入2%脫脂奶粉的TTBS按比例稀釋的待測血清中，4℃下過夜。

1.2.2.4封閉及雜交將膜取出,用去離子水與TTBS稍加漂洗，在含封閉液與抗體溶劑中室溫封閉1.5 h，加入按1∶6 000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG溶液，室溫下1 h。再用TTBS漂洗膜后再浸洗3次。

1.2.2.5發(fā)光鑒定ECL化學發(fā)光法顯色，結果經自動電泳凝膠成像分析儀采集[5]。

2結果

2.1兩組臨床表現(xiàn)比較觀察組和對照組在性別、病程、血肌酐以及皮疹、乏力、消化系統(tǒng)癥狀等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；觀察組平均年齡和BVAS分別為(41.08±9.43)歲和(15.03±3.82)分，明顯低于對照組，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；觀察組出現(xiàn)發(fā)熱、關節(jié)痛的比例分別為26.67%和13.33%，明顯低于對照組，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；觀察組出現(xiàn)腎病綜合征比例為48.89%，高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2兩組AECA陽性率比較觀察組血清AECA陽性率為46.67%，明顯低于對照組的81.63%，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3兩組血清IgG-AECA蛋白識別情況觀察組IgG-AECA共識別7種不同的蛋白，分別為56、76、90、123、178和200 kD，而對照組IgG-AECA共識別11種不同的蛋白，分別為43、56、69、76、90、110、123、159、168、178和200 kD。見圖1。觀察組抗90 kD抗體陽性率為13.33%(6/45)，明顯低于對照組的51.02%(25/49)，差異比較有統(tǒng)計學意義(χ2=14.158，P<0.05)；其他自身抗體比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

IndexObservation(n=45)Control(n=49)t/χ2PMale/Female26/1930/190.0130.910Age(year)41.08±9.4360.82±12.90-7.6970.000Durationofdisease(month)6.21±3.106.08±2.520.2120.843BVAS15.03±3.8221.26±4.57-6.5850.000Fever12(26.67)38(77.55)22.2600.000Arthralgin6(13.33)21(42.56)9.6470.002Erythra9(20.00)11(22.45)0.3560.551Feeble17(37.78)25(51.02)0.5450.460Nephroticsyndrome22(48.89)7(14.29)21.3080.000Symptomofdigestivesystem5(11.11)6(12.24)0.0750.785Scr(μmol/L)601.10±89.43642.08±96.83-1.9730.061

Note：BVAS is short for Birminham systemic vasculitis activity score.

表2兩組血清AECA陽性率比較[n(%)]

Tab.2Comparison of AECA positive rate in two groups[n(%)]

GroupnAECApositiveχ2PObservation4521(46.67)11.8610.001Control4940(81.63)

圖1　Western blot 檢測圖Fig.1　Western blot test chartNote: 1-6.Observation group；7-9.Control group；10.Blank control.

2.4觀察組IgG-AECA蛋白與臨床表現(xiàn)的關系觀察組抗76 kD抗體陽性患者出現(xiàn)皮疹的比例為100%(5/5)，陰性患者出現(xiàn)皮疹的比例為2.5%(1/40)，差異比較有統(tǒng)計學意義(χ2=21.800，P<0.05)；抗200 kD抗體陽性患者BVAS評分為(18.02±2.51)分，陰性患者為(14.10±3.15)分，差異比較有統(tǒng)計學意義(t=2.855，P<0.05)。其他自身抗體與臨床指標之間未發(fā)現(xiàn)相關性。

3討論

新月體腎小球腎炎(CGN)是腎小球腎炎中最嚴重的一種類型，也是腎臟科常見的急危重癥。少免疫沉積型(PICGN)是CGN的一種， PICGN是指無或僅有少量免疫復合物沉積于腎小球的CGN，通常認為PICGN是系統(tǒng)性小血管炎腎臟受累引起[5]。PICGN其主要的臨床表現(xiàn)為水腫、蛋白尿、血尿和高血壓等。并且PICGN多伴有腎外器官受累，如心肌缺血改變、心包炎和血管炎性皮疹等并發(fā)癥[6]。經研究發(fā)現(xiàn)PICGN患者血清中抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)既有呈陽性又有呈陰性的，但對ANCA呈陰性患者研究較少。并且筆者發(fā)現(xiàn)ANCA 呈陽性或陰性的PICGN患者均可能與抗內皮細胞抗體(AECA)表達有關。

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)是一種以單核細胞和中性粒細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體譜，主要包括髓過氧化物酶 (MPO)、蛋白酶3(PR3)、組織蛋白酶G(GG)、乳鐵蛋白 (LF) 和溶菌酶(LYS)等[7]。研究顯示ANCA與系統(tǒng)性血管炎的發(fā)生密切相關，而ANCA相關小血管炎常累及腎臟，典型的病理表現(xiàn)為PICGN，因此，ANCA在PICGN的發(fā)病中起到重要作用[8]。AECA是一組異質性抗體，可引起細胞損傷和誘導內皮細胞凋亡，主要存在于與血管炎有關的自身免疫性疾病，為血管受損和血管炎的標記[9]。此外，AECA本身具有致病性，研究顯示，AECA與多種疾病的發(fā)生密切相關，如SLE、狼瘡性腎炎、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、混合性結締組織病和系統(tǒng)性血管炎等[10]，因此，血清AECA可以作為一種用于評估、診斷病情和判斷預后的血清學指標，在自身免疫性血管炎致病過程中的作用越來越受到重視[11]。而關于ANCA陰性PICGN患者血清AECA與臨床表現(xiàn)的關系目前尚無報道[12]，為研究AECA與陰性PICGN的臨床表現(xiàn)的關系，本次實驗就抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清抗內皮細胞抗體(AECA)表達情況，及其與臨床表現(xiàn)的關系進行探討。

本次實驗通過對ANCA陰性與ANCA陽性PICGN患者平均年齡和伯明翰血管炎活動性評分(BVAS)、臨床表現(xiàn)及識別IgG-AECA種類進行比較，結果發(fā)現(xiàn)ANCA陰性患者與ANCA陽性PICGN患者在以上各個方面存在顯著性差異(P<0.05)。ANCA陰性PICGN患者血清中識別出7種不同AECA。說明PICGN患者ANCA陰性時可以檢測到AECA，AECA可能與PICGN疾病的活動性有關，但具體關系不明。并且ANCA陰性與ANCA陽性PICGN患者識別的IgG-AECA種類不同，臨床表現(xiàn)也存在差異，說明兩者臨床表現(xiàn)的差異可能與AECA的不同有關，但具體關系不明。

綜上所述，我們認為ANCA陰性少免疫沉積型新月體性腎炎患者血清存在不同的AECA，可能與某些臨床表現(xiàn)有關；ANCA陰性和陽性患者AECA有所不同，兩者臨床表現(xiàn)的差異可能與AECA的不同有關，由于本研究選取的樣本量較小，具體關系還需近一步的深入研究。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-26]

(編輯倪鵬)

Relationship between serum AECA and clinical signatures of ANCA negative pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis patients

DONG Xiang-Nan,CAO Rui,YIN Liang-Hong.

The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou,510632，China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of anti-endothelial cell antibodies(AECA) in patients serum with anti-neutrophil cytoplasmic antibody(ANCA) negative pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis and its relationship with clinical signatures.Methods: We selected 94 pauci-immune deposition type crescentic glomerulonephritis patients from 2010 to 2015 treated in our hospital,45 of which with ANCA-negative(observation group) and 49 cases of ANCA-positive patients (control group),AECA levels of each groups serum were detected by Western blot test.Results: The average age of the observation group and Bermingham vasculitis activity score(BVAS) respectively (41.08 + 9.43) years old and (15.03 + 3.82),significantly lower than the control group (P<0.05);the observation group had fever,joint pain accounted for 26.67% and 13.33%,significantly lower than the control group (P<0.05);the observation group of nephrotic syndrome accounted for 48.89%,higher than the control group (P<0.05);observation group positive rate of serum AECA was 46.67%,significantly lower than the control group 81.63% (P<0.05);the observation group IgG-AECA identified 7 proteins,while the control group had identified 11 proteins,of which the observation group the positive rate of anti 90 kD antibody was 13.33%(6/45),significantly lower than the control group 51.02%(25/49) (P<0.05);observation group of anti 76 kD antibody positive patients had rash ratio of 100%,significantly higher than negative patients (P<0.05),anti 200 kD antibody positive the BVAS score of the patients was (18.02 + 2.51),which was significantly higher than that of the negative patients (P<0.05).Conclusion: The different level of AECA in ANCA negative pauci-immune crescentic glomerulonephritis patients may be associated with certain clinical manifestations;clinical manifestations differences between the ANCA negative and positive patients may be associated with different expression of the AECA related,the detail need a further study.

[Key words]ANCA;AECA;Pauci-immune deposition type;Crescentic glomerulonephritis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.023

作者簡介：董向楠(1984年-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腎臟病理學方面研究。

通訊作者及指導教師：尹良紅(1961年-)，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事血液透析及其并發(fā)癥的診斷方面研究。

中圖分類號R593.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0875-04