劉麗楠　李敬華　王素莉　程　晨　侯雯莉　關樹梅　張　紅

(中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院內分泌科，天津300162)

B10細胞與非肥胖型糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的關系研究

劉麗楠李敬華王素莉程晨侯雯莉關樹梅張紅

(中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院內分泌科，天津300162)

[摘要]目的：研究B10細胞與非肥胖型糖尿病小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的關系。方法：選擇20只6周齡NOD/LT雌性小鼠進行常規(guī)培養(yǎng)至30周齡，根據小鼠血糖、血肌酐和體重情況將小鼠分為自身免疫性糖尿病未發(fā)生組和發(fā)生組。利用酶聯(lián)吸附反應檢測兩組小鼠脾臟組織中IL-10水平。利用流式細胞分選術檢測兩組小鼠脾臟組織匯總B10細胞比例。將40只6周齡NOD/LT雌性小鼠分為對照組和B10組，B10組小鼠接種分離得到的B10細胞，每周一次，對照組接種同等體積生理鹽水，分別于第10、15、20、25、30周齡時檢測小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。結果：發(fā)生組小鼠血糖和血肌酐水平顯著高于未發(fā)生組(P<0.05)，體重水平顯著低于未發(fā)生組(P<0.05)。發(fā)生組小鼠脾臟組織中IL-10水平顯著高于未發(fā)生組。自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中B10細胞含量顯著高于未發(fā)生組。當小鼠處于第10、15周齡時，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著低于對照組，但第20、25、30周時，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著高于對照組。結論：B10細胞的過度積累，可能是進一步誘發(fā)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的原因之一。

[關鍵詞]B10細胞；非肥胖型糖尿病小鼠；自身免疫性糖尿病

B細胞是機體內參與抗體分泌、抗原呈遞、傳遞刺激信號等過程的重要免疫調節(jié)細胞，除此之外，B細胞還具有負向免疫調節(jié)功能，從而導致非肥胖型糖尿病(Nonobese diabetic，NOD)、自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmuneencephalomy-elitis，EAE)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemiclupuserythe-matosus，SLE)等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[1]。B10細胞是2008年確認鑒定出的一種重要調節(jié)性B細胞， WT小鼠被LPS+佛波酯+離子霉素+莫能菌素(Phorbol ester+ionomycin+monensin，PIM) 刺激5 h后，其脾臟組織中可分離得到的CD5+CD1dhighCD19highB細胞亞群，這類細胞是B細胞產生IL-10的主要來源，因此稱為B10細胞，目前研究發(fā)現在自身免疫性疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的負向調節(jié)作用[2,3]。1型糖尿病是由于胰島素β細胞被自身免疫系統(tǒng)攻擊破壞后，引起胰島素分泌障礙，導致血糖濃度升高的自身免疫性糖尿病[4]。在NOD/LT小鼠中，自身免疫性糖尿病的發(fā)生率高達80%[5]。因此，本文主要研究B10細胞與非肥胖型糖尿病小鼠的自身免疫性糖尿病發(fā)生的關系。

1材料與方法

1.1動物飼養(yǎng)及樣本收集20只6周齡NOD/LT雌性小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，許可證號:SCXK(滬)2003-0003。SPF級常規(guī)飼養(yǎng)。于NOD/LT小鼠30周齡時，稱量體重，尾靜脈采血,用快速血糖儀(One touch ultra)測定全血血糖，血糖>16.7 mmol/L為糖尿病小鼠，并檢測血肌酐濃度，統(tǒng)計NOD/LT小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。根據發(fā)生情況將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體重)腹腔麻醉全部小鼠，手術取小鼠脾臟組織，一部分液氮凍存用于檢測IL-10水平。一部分用于分離B10細胞。重新購買40只6周齡NOD/LT雌性小鼠用于后續(xù)試驗。本實驗通過本院倫理協(xié)會同意。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)吸附反應檢測NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平將凍存的脾臟組織進行液氮研磨，利用IL-10 ELISA試劑盒(購自北京天根公司)檢測NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平。操作根據說明書進行。

1.2.2流式細胞分選術(FACS)分選B10細胞將新鮮的NOD/LT小鼠脾臟組織進行酶解消化，經200目篩網過濾，保證所分離的細胞為單個細胞，制備脾臟淋巴細胞懸液，流式抗體CD5、CD1d和CD19進行染色，采用FACS分選CD5+CD1dhighCD19highB細胞。

1.2.3B10細胞對NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響將新鮮的NOD/LT小鼠脾臟組織進行酶解消化，經200目篩網過濾，保證所分離的細胞為單個細胞，制備脾臟淋巴細胞懸液，利用聯(lián)合免疫磁珠分選術分離得到CD19high細胞，按照1x104濃度接種于24孔板中。加入10 μg/ml LPS、50 ng/ml 佛波酯、500 ng/ml 離子霉素和2 μmol/L莫能菌素刺激5 h，提高CD5+CD1dhighCD19highB細胞含量。將第二次購買的NOD/LT小鼠隨機分為對照組和B10組，每組20只。將分離得到的B10細胞制備成2×104的細胞懸液，接種到B10組小鼠體內中，每周一次。對照組接種同等體積生理鹽水。SPF常規(guī)培養(yǎng)，分別于小鼠第10、15、20、25、30周齡時取小鼠尾靜脈血檢測小鼠血糖水平，統(tǒng)計NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。

2結果

2.1NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況當NOD/LT小鼠培養(yǎng)至30周齡后，檢測小鼠血糖、血肌酐和體重情況。結果顯示，20只小鼠中血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠共11只，低于16.7 mmol/L的小鼠共9只，即NOD/LT小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率為55%。據此將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組，統(tǒng)計分析兩組小鼠血糖、血肌酐和體重情況，發(fā)生組小鼠血糖水平(29.24±7.48)顯著高于未發(fā)生組(8.99±6.12，P<0.05)，發(fā)生組小鼠血肌酐水平(24.39±2.93)顯著高于未發(fā)生組(42.65±3.74，P<0.05)，發(fā)生組小鼠體重水平(286.48±27.83)顯著低于未發(fā)生組(153.47±25.31，P<0.05)，見表1。

2.2NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平和B10細胞含量收集NOD/LT小鼠脾臟，利用ELISA是結合檢測脾臟組織中IL-10水平，利用流式細胞術分析B10細胞所占淋巴細胞比例，結果顯示自身免疫性糖尿病發(fā)生組IL-10水平(17.752±3.925)顯著高于未發(fā)生組(8.438±1.386)，同時B10細胞占比(5.61%)明顯高于未發(fā)生組(1.27%，P<0.05)，見圖1，表2。

表1NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況

Tab.1Incidence of autoimmune diabetes in NOD mice

GroupsnBloodglucose(mmol/L)Serumcreatinine(μmol/L)Weight(g)Noneautoimmunediabetes9(45%)8.99±6.1224.39±2.93286.48±27.83Autoimmunediabetes11(55%)29.24±7.4842.65±3.74153.47±25.31

圖1　NOD/LT小鼠脾臟組織中B10細胞含量Fig.1　Levels of B10 cells in spleen of NOD mice

表2NOD/LT小鼠脾臟組織中IL-10水平和B10細胞含量

Tab.2Levels of IL-10 and B10 cells in spleen of NOD mice

GroupsnIL-10(ρ/ng/L)B10(%)Noneautoimmunediabetes98.438±1.3861.27%Autoimmunediabetes1117.752±3.9255.61%

表3B10細胞對NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響[n(%)]

Tab.3Effects of B10 cells on autoimmune diabetes in NOD mice[n(%)]

Groups10weeks15weeks20weeks25weeks30weeksControlgroup2(10%)5(25%)8(40%)10(50%)12(60%)B10group0(0%)3(15%)12(60%)18(90%)20(100%)

2.3B10細胞對NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響將分離得到的B10細胞稀釋成濃度為2×104的細胞懸液接種到6周齡NOD/LT小鼠體內，分別于小鼠第10、15、20、25、30周齡時檢測小鼠血糖水平，檢測NOD/LT小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生情況。結果顯示B10組小鼠在第10、15、20、25、30周齡時，血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠數量分別為0、3、12、18、20只，而對照組小鼠在第10、15、20、25、30周齡時時，血糖濃度高于16.7 mmol/L的小鼠數量分別為2、5、8、10、12只，因此B10組小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生率在小鼠第10(0%)和15周齡(15%)時低于對照組(10%，25%)，但是在第20、25、30周齡(60%、90%、100%)時小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生率高于對照組(40%、50%、60%)，見表3。

3討論

1型糖尿病是由于胰島素β細胞被自身免疫系統(tǒng)攻擊破壞后，引起胰島素分泌障礙，導致血糖濃度升高的自身免疫性糖尿病。在NOD小鼠中，自身免疫性糖尿病的發(fā)生率高達80%。目前研究認為NOD小鼠發(fā)生自發(fā)性糖尿病主要由于自身抗原缺乏耐受引起的[6]。非肥胖型糖尿病、自身免疫性腦脊髓膜炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的發(fā)生都是由于B細胞的負向免疫調節(jié)功能引發(fā)的機體過度免疫反應造成的[7]。在機體內，調節(jié)性B細胞(regulatory B cells，Bregs)是參與負向免疫調節(jié)的主要B細胞亞群，其免疫功能主要通過調節(jié)白介素10(Interleukin 10，IL-10)和轉化生長因子β(Transfor ming growth factor β，TGFβ)完成[8]。CD5+CD1dhighCD19highB細胞是此亞群中的主要成員，負責免疫組織中大部分IL-10的分泌，因此又稱為B10細胞。因此，本文主要研究B10細胞與非肥胖型糖尿病小鼠的自身免疫性糖尿病發(fā)生的關系。

本研究中，我們選擇20只6周齡NOD/LT小鼠進行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至30周齡時，對其血糖、血肌酐水平和體重情況進行檢測，結果顯示其中11只小鼠出現自身免疫性糖尿病，據此將小鼠分為未發(fā)生組和發(fā)生組，統(tǒng)計分析兩組小鼠血糖、血肌酐和體重情況，發(fā)生組小鼠血糖和血肌酐水平顯著高于未發(fā)生組(P<0.05)，體重水平顯著低于未發(fā)生組(P<0.05)。同時我們利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組小鼠脾臟組織中IL-10水平，結果顯示自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中IL-10水平顯著高于未發(fā)生組。利用流式細胞分選術分析發(fā)現，自身免疫性糖尿病發(fā)生組小鼠脾臟組織中B10細胞含量顯著高于未發(fā)生組。說明IL-10水平和B10細胞在NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生過程中可能發(fā)揮著重要作用，這可能是由于小鼠自身免疫促進B10細胞的擴增引起的。

由于B10細胞除了參與抗體分泌、抗原呈遞、傳遞刺激信號等過程之外，還可作為接觸性超敏反應(Contact hypersensitivity，CHS)等疾病的特異性抗原，這有可能是引發(fā)負向免疫調節(jié)的主要原因[9]。因此我們將B10細胞接種到6周齡NOD/LT小鼠，研究B10細胞對NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的影響。為了提高B10細胞濃度，我們首先利用聯(lián)合免疫磁珠分選術分離得到CD19high細胞，繼而利用LPS+佛波酯+離子霉素+莫能菌素處理，提高CD5+CD1dhighCD19highB細胞比例，得到濃度較高的B10細胞。將B10接種到NOD小鼠體內，分別于第10、15、20、25、30周齡時檢測小鼠尾靜脈血液中血糖濃度。結果顯示，當小鼠處于第10,15周齡時，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著低于對照組，但第20周以后，B10組小鼠中自身免疫性糖尿病發(fā)生率顯著高于對照組。白介素10是一種多功能的細胞因子，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，參與調節(jié)細胞的生長與分化以及炎性和免疫反應[10]。因此我們認為在NOD小鼠成長初期，B10細胞分泌的IL-10發(fā)揮其炎癥抑制作用，延緩了NOD小鼠自

身免疫性糖尿病的發(fā)生，但當B10細胞在NOD小鼠體內積累，激活小鼠體內負向免疫調節(jié)，導致NOD小鼠自身免疫性糖尿病的發(fā)生率的上升。

總之，在發(fā)生自身免疫性糖尿病的NOD小鼠中，B10細胞增多，而B10細胞的過度積累，可能是進一步誘發(fā)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)生的原因之一。

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[收稿2015-09-03修回2015-09-30]

(編輯許四平)

Relationship between B10 cells and incidence of autoimmune diabetes in non-obese diabetic mice

LIU Li-Nan,LI Jing-Hua,WANG Su-Li,CHENG Chen,HOU Wen-Li,GUAN Shu-Mei,ZHANG Hong.

The Endocrinology Department of the Affiliated Hospital of Logistics Institute of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162,China

[Abstract]Objective:To study relationship between B10 cells and the incidence of autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice.Methods: 20 NOD/LT female mice of 6 week old were cultured in normal culture to 30 weeks,and the mice were divided into two groups according the mice′s blood glucose,serum creatinine and body weight detected at their 30 weeks old.IL-10 levels in spleen tissues of the two groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.We used flow cytometry to detect the proportion of B10 cells in the spleen of mice in the two groups.NOD/LT mice were randomly divided into control group and B10 group.The B10 cells were inoculated in B10 groups,their blood glucose were detected when they were 10,15,20,25 and 30 weeks old.Results: The blood glucose and serum creatinine levels were significantly higher in the group than that in the autoimmune diabetes group (P< 0.05),and the body weight was significantly lower than that in the autoimmune diabetes group (P< 0.05).The level of IL-10 in the spleen tissues of the autoimmune diabetes mice was significantly higher than that in the non autoimmune diabetes group.The content of B10 cells in the spleen of the mice with autoimmune diabetes mellitus was significantly higher than that in the non autoimmune diabetes group.When mice at the age of 10,15 weeks,the incidence of autoimmune diabetes in B10 group was significantly lower than that in the control group,but the incidence of autoimmune diabetes in B10 group was significantly higher than that in control group at 20,25 and 30 weeks.Conclusion: The over accumulation of B10 cells may be one of the reasons for the further development of autoimmune diabetes in NOD mice.

[Key words]B10 cells;Nonobese diabetic mice;Autoimmune diabetes

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.009

作者簡介：劉麗楠(1978年-)，女，碩士，主治醫(yī)師、講師，主要從事內分泌代謝性疾病的基礎與臨床研究。

中圖分類號R587.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0812-04