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        SIRT1抑制劑sirtinol對前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響及可能機制

        2016-06-29 09:41:26張大田石建國
        中國老年學(xué)雜志 2016年11期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞凋亡前列腺癌

        張大田 石建國 張 強 劉 巖

        (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧 錦州 121001)

        SIRT1抑制劑sirtinol對前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響及可能機制

        張大田石建國張強劉巖

        (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧錦州121001)

        〔摘要〕目的觀察SIRT1抑制劑sirtinol對前列腺癌DU145細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子(Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3)表達(dá)變化的影響,探討SIRT1在前列腺癌發(fā)生的可能機制。方法體外培養(yǎng)DU145細(xì)胞,實驗分對照組(DMSO組)和sirtinol組(終濃度為10,25和50 μmol/L),Western 印跡檢測DU145細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;Western 印跡檢測DU145細(xì)胞中細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組相比,隨著sirtinol濃度的增加,SIRT1蛋白表達(dá)水平逐漸降低,細(xì)胞凋亡比例增加,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后Bcl-2蛋白表達(dá)減少,且隨劑量增加表達(dá)越低;Bax蛋白表達(dá)增加,Bcl-2/Bax比率降低;伴隨Cytochrome C的釋放和Caspase-3的激活。結(jié)論下調(diào)SIRT1表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DU145細(xì)胞凋亡,其機制可能與改變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)相關(guān)。

        〔關(guān)鍵詞〕SIRT1;sirtinol;前列腺癌;DU145;細(xì)胞凋亡

        前列腺癌發(fā)生是一個多因素和多階段的復(fù)雜過程,隨著與前列腺癌密切相關(guān)的癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn),前列腺癌的發(fā)病機制逐漸闡明〔1,2〕;前列腺在體內(nèi)位置比較表淺,基因治療藥物可直接安全通過腔內(nèi)注射到病灶使前列腺癌的基因治療成為研究熱點〔3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白去乙?;浮?〕,它通過去乙?;揎椊M蛋白和眾多的非組蛋白(STAT3、p53、FOXO家族等)維持染色質(zhì)的沉默和基因組穩(wěn)定并參與調(diào)控細(xì)胞的能量代謝、凋亡、衰老、腫瘤和神經(jīng)退行性病變等體內(nèi)多種生物學(xué)過程〔5~7〕。SIRT1在不同的腫瘤類型中表達(dá)相差甚遠(yuǎn),SIRT1在人前列腺癌、結(jié)腸癌、急性髓細(xì)胞白血病等腫瘤中高表達(dá),而在膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤和卵巢癌中的表達(dá)明顯受抑制〔8,9〕。前列腺癌中SIRT1的作用在國內(nèi)外的報道也不盡相同〔2,3〕,因此本研究使用不同濃度的SIRT1抑制劑sirtinol作用前列腺癌細(xì)胞DU145,探討下調(diào)SIRT1表達(dá)對人前列腺癌細(xì)胞系凋亡的影響。

        1材料與方法

        1.1主要試劑與儀器sirtinol〔S8825,≥98% (HPLC),Sigma公司〕;DMEM培養(yǎng)液(Corning公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Mbchem公司);SIRT1和Bcl-2(鼠單克隆抗體,Merck Millipore公司)、Bax、Caspase-3(兔單克隆抗體,CST公司)、Cytochrome C(兔單克隆抗體,Abcam公司)、β-actin抗體(兔多克隆抗體,Santacruz公司);HRP標(biāo)記的山羊抗兔,抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology公司);Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司);BB16UV CO2培養(yǎng)箱(Heraeus);水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ 40B型(北京六一儀器廠);電泳儀(Bio-Rad,美國);流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組人前列腺癌細(xì)胞DU145購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,飽和濕度、37℃和5%CO2孵箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,以1×105/ml濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中或96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后給藥,sirtinol組終濃度分別為10、25和50 μmol/L,對照組加入5 μl DMSO〔DMSO濃度小于0.1%(V/V),此濃度對細(xì)胞生長無影響〕。

        1.3倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞24 h或48 h后取出培養(yǎng)瓶,于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)特征。

        1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡DU145細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的sirtinol干預(yù)SIRT1的活性,上述細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶-EDTA消化,離心各種處理的細(xì)胞,無菌PBS液洗滌2次;加入FITC-annexin和100 μg/ml PI染液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液,室溫孵育 15 min,各組細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測,CellQuest 分析軟件分析各組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例。

        1.5Western 印跡檢測Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)蛋白裂解液提取各實驗組細(xì)胞總蛋白, BCA法測定蛋白濃度,-20℃或-80℃保存?zhèn)溆谩k娪厩?,加?×SDS樣品緩沖液,100℃煮沸5 min,離心后上樣,10%SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,含5%BSA的TBST(pH7.4)室溫?fù)u動2 h封閉濾膜,取出后的濾膜分別與SIRT1,Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase-3及β-actin(稀釋比為1∶1 000) 4℃溫育過夜。TBST洗滌3次,HRP耦聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h,洗膜后, ECL發(fā)光顯色。

        1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Graphpad prism 5軟件,行方差分析。

        2結(jié)果

        2.1sirtinol對DU145細(xì)胞形態(tài)特征的影響對照組的細(xì)胞貼壁生長,長梭形,大小較均一,細(xì)胞呈半透明狀,生長速度較快;經(jīng)sirtinol作用后,細(xì)胞皺縮,細(xì)胞內(nèi)有空泡形成,大小不一,折光性變差,懸浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片增加。

        2.2SIRT1蛋白表達(dá)水平的檢測與對照組相比,隨著sirtinol濃度的增加,SIRT1蛋白表達(dá)水平逐漸降低(圖1)。

        1~4:0、10、25、50 μmol/L sirtinol圖1 不同濃度sirtinol處理 DU145細(xì)胞后SIRT1蛋白表達(dá)水平

        2.3sirtinol對DU145細(xì)胞凋亡影響對照組有大量活細(xì)胞,不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后,隨著藥物濃度的升高,凋亡細(xì)胞所占比例逐漸增加(P<0.01),但sirtinol濃度增加到50 μmol/L時,壞死細(xì)胞也明顯增加。10~25 μmol/L sirtinol處理后大量活細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡,但死亡細(xì)胞的數(shù)量變化不大。而細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L sirtinol作用后,壞死細(xì)胞增加明顯。見表1。

        表1 不同濃度sirtinol處理 DU145細(xì)胞后

        與0 μmol/L sirtinol組比較:1)P<0.01

        2.4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白表達(dá)水平與對照組比較,各sirtinol濃度組DU145細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少,且隨劑量增加表達(dá)減少;Bax蛋白表達(dá)增加,Bcl-2/Bax比率降低;伴隨大量Cytochrome C的釋放和Caspase-3的激活(圖2)。

        1~4:0、10、25、50 μmol/L sirtinol圖2 不同濃度sirtinol作用DU145細(xì)胞后Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表達(dá)

        3討論

        本研究結(jié)果說明sirtinol可以改變內(nèi)源性SIRT1表達(dá),表明SIRT1與DU145細(xì)胞增殖密切相關(guān)。

        細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡,是各種因素觸發(fā)細(xì)胞死亡程序而引起的細(xì)胞主動性死亡。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、器官生成、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。本文結(jié)果表明,活細(xì)胞僅有很低的熒光強度(PI/AV),早期凋亡細(xì)胞開始出現(xiàn)綠色熒光(PI/AV+),晚期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)極強的綠色熒光(PI+/AV+),壞死細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色(PI+/AV)。和對照組相比,sirtinol處理后增加細(xì)胞凋亡比例,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。線粒體凋亡途徑是哺乳動物細(xì)胞中重要的細(xì)胞凋亡信號〔10〕。Bcl-2家族參與線粒體凋亡途徑的起始引發(fā),其中Bcl-2,Bcl-XL和Mcl-1是主要的抗凋亡因子,且均能抑制Cytochrome C的釋放,使其無法激活下游Caspase,保護細(xì)胞不發(fā)生凋亡。而Bcl-2家族中的Bax,Bak,Bik和 Bid是促凋亡蛋白,引起Cytochrome C的釋放,誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔11〕。本文結(jié)果表明Bcl-2 家族中凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比率變化是sirtinol作用DU145細(xì)胞后引發(fā)的凋亡。同時也發(fā)現(xiàn)sirtinol作用DU145細(xì)胞后有大量Cytochrome C的釋放和caspase-3的激活,這與Lee等〔12〕人的報道相一致。以上結(jié)果表明,sirtinol引起的DU145細(xì)胞凋亡可能是通過線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的。

        綜上,本研究證實下調(diào)內(nèi)源性SIRT1的表達(dá)促進細(xì)胞凋亡,其機制可能與改變細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的表達(dá)相關(guān),提示SIRT1在前列腺癌的發(fā)生中可能扮演癌基因的角色。

        4參考文獻

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        〔2014-10-17修回〕

        (編輯趙慧玲/曹夢園)

        基金項目:遼寧省科技廳科學(xué)計劃項目資助課題(2011225015)

        通訊作者:劉巖(1976-),男,副教授,碩士,主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤生物學(xué)研究。

        〔中圖分類號〕R581.3

        〔文獻標(biāo)識碼〕A

        〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2599-03;

        doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.013

        第一作者:張大田(1969-),男,副主任醫(yī)師,碩士,主要從事泌尿腫瘤生物學(xué)研究。

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