靳彩虹（甘肅醫(yī)學(xué)院生化教研室，甘肅平?jīng)?44000）

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“肝中酮體的生成作用”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)及技巧

靳彩虹
（甘肅醫(yī)學(xué)院生化教研室，甘肅平?jīng)?44000）

摘要：通過(guò)分析“肝中酮體的生成作用”實(shí)驗(yàn)中學(xué)生在小白鼠抓取、處死、組織勻漿液制備、反應(yīng)液配制等環(huán)節(jié)中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，提出了一系列改進(jìn)方法及技巧，規(guī)范了操作，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：小白鼠；酮體；實(shí)驗(yàn)改進(jìn)；實(shí)驗(yàn)技巧

Abstract:Through the analysis of various problems which occurs in the experiment of "the generation of ketone bodies in liver" when students fetched mice，executed mice，tissued mice serum and reaction liquid preparation，the paper puts forward a series of improvement methods and skills to standardize the operations and improve experimental teaching results.

Keywords:mice；ketone bodies；experimental improvements；experimental skills

生物化學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性學(xué)科，實(shí)驗(yàn)對(duì)于加深理論知識(shí)的理解、鞏固記憶，培養(yǎng)分析解決問(wèn)題能力以及提高創(chuàng)新思維等方面有著極其重要的意義。“肝中酮體的生成作用“是我校?？粕谏锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中選做的唯一一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，學(xué)生實(shí)驗(yàn)中往往出現(xiàn)各種問(wèn)題影響著教學(xué)效果。作者結(jié)合多年教學(xué)經(jīng)驗(yàn)談幾點(diǎn)實(shí)驗(yàn)改進(jìn)技巧，旨在解決學(xué)生實(shí)驗(yàn)中的存在問(wèn)題，提高實(shí)驗(yàn)成功率，同時(shí)，提升學(xué)生的綜合素質(zhì)。

一、實(shí)驗(yàn)原理

利用丁酸作為底物，與含有酮體生成酶系的肝勻漿混勻、保溫后即有酮體生成。酮體中乙酰乙酸和丙酮可與含亞硝酰鐵氰化鈉的顯色粉反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物；而經(jīng)過(guò)同樣處理的肌肉勻漿，則不產(chǎn)生酮體，因此，與顯色粉作用無(wú)顏色反應(yīng)。

二、基本操作步驟

首先，取小白鼠一只，處死，迅速剖腹取出肝臟和肌肉組織，剪碎，分別放入勻漿器中，加入生理鹽水（按重量：體積為1：3），研磨成勻漿（加少許細(xì)砂）。然后取試管四支，編號(hào)后按表1加入各種試劑。搖勻四支試管，置于37℃恒溫水浴中保溫40～50分鐘后取出，各管再分別加入15%三氯醋酸20滴，搖勻混合，離心3分鐘（3000轉(zhuǎn)/分）。最后，分別取出上述各管離心液10滴放于有凹白瓷反應(yīng)板上，每凹加顯色粉1小匙（約0.1g）攪勻，觀察所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)［1，2］。

表1　肝中酮體生成作用反應(yīng)液

三、理論結(jié)果

第一管為紫紅色，其他試管為無(wú)色。

四、實(shí)驗(yàn)中存在的問(wèn)題及改進(jìn)技巧

（一）處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由于學(xué)生初次接觸小白鼠，實(shí)驗(yàn)中狀況百出：如有的逗著玩、不忍心處死、觀望、不動(dòng)手實(shí)驗(yàn)；有的不敢碰，小鼠亂跑，學(xué)生亂叫，不會(huì)抓??；有的將小鼠塞進(jìn)水里淹死；有的斷頭處死。在教學(xué)中我們首先教育學(xué)生要善待小動(dòng)物，不隨便傷害他們。實(shí)驗(yàn)用小白鼠要求在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下盡量選擇不很痛苦死亡方式。實(shí)驗(yàn)前老師先示教：即右手拿鑷子迅速?gòu)念i背部按壓住小鼠后，左手拇指和食指分別捏住小鼠兩耳，小指和小魚際夾住尾巴，翻過(guò)來(lái)使小鼠腹部朝上。在正確抓取之后，換右手迅速用拇指和食指捏住尾巴，快速輪轉(zhuǎn)，再猛摔頭于地上，最后使其頸部脫臼致死。這樣摔死方法可以避免學(xué)生被小鼠抓傷、咬傷，小鼠死亡時(shí)間短、出血也少。同上，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

（二）組織剪切

本實(shí)驗(yàn)要求剪下小鼠的肝臟及兩個(gè)大腿的肌肉。學(xué)生實(shí)驗(yàn)中常見小鼠的肝臟被夾碎，出血對(duì)多；直接剪下雙大腿，拿

在手中撥毛皮，再剪肌肉，制備的肌勻漿中混有毛和骨頭。針對(duì)這種情況，我們首先按手術(shù)學(xué)要求給學(xué)生示教：鑷子是拇指對(duì)中指與食指，執(zhí)二鑷腳中上部；剪刀持法是用拇指和第四指分別插入剪刀柄兩環(huán)中，中指在第四指環(huán)的剪刀柄上，食指壓在軸節(jié)處起穩(wěn)定和向?qū)ё饔谩＜糸_腹部皮膚及皮下組織，打開腹膜，暴露出肝臟，用鑷子輕輕夾住肝臟游離緣，剪刀沿肝臟根部一葉一葉完整剪出肝葉，這樣剪取肝臟出血少。取腿部肌肉時(shí)，在膝關(guān)節(jié)處先一手用鑷子提起皮膚，剪開膝上部一圈的皮膚，夾住膝部，用剪刀向大腿近端刮撥皮毛就可以暴露出肌肉，一點(diǎn)點(diǎn)地剪下肌肉即可，不必剪斷雙腿骨頭。試驗(yàn)中還可以提示學(xué)生是否能采用其它組織（如腎臟等）代替肌肉組織。

（三）勻漿液制備

小鼠肝臟較小，酶活性弱，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可能不明顯，可以合并兩個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)的兩只小鼠的肝臟，用水沖洗干凈表面的血，再制備勻漿液。肌肉勻漿液也同樣收集兩只小鼠的四條后大腿肌肉制備。

（四）試劑量取與反應(yīng)液制備

本實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)，試劑用滴管加，顯色粉用藥匙加。學(xué)生常犯錯(cuò)誤是多種試劑共用一個(gè)滴管加，取試劑前不清洗，這樣使試劑相混；有的學(xué)生不搖勻就保溫。由于四管的區(qū)別主要是肝勻漿和肌勻漿，故要特別強(qiáng)調(diào)每加一種試劑一定要清洗滴管，養(yǎng)成每取完一種試劑將本試劑瓶蓋蓋好，滴管放入盛有蒸餾水的燒杯中，使用前清洗的習(xí)慣。實(shí)驗(yàn)中也常見學(xué)生每人拿一支試管滴加試劑，保溫、離心等，這樣使得每管反應(yīng)液從量到質(zhì)差異較大。為減少人為因素造成的誤差。除了每種試劑盡量由同一操作者同時(shí)加入，以把握試劑量的均勻一致外，還可以將滴數(shù)換算為體積［3］（每ml約15～25滴，平均20滴），用吸量管或微量進(jìn)樣器加入。一勺顯色分稱量后，取等量顯色分加入其它三只試管。

（五）保溫

本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物處死、肌肉和肝臟勻漿液制備、滴加試劑、保溫、離心到顯色，大約需要90分鐘，學(xué)生往往操作不熟練，不能再有限的課時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)?？梢蕴崾緦W(xué)生結(jié)合酶學(xué)相關(guān)知識(shí)思考如何能縮短反應(yīng)時(shí)間？學(xué)生會(huì)聯(lián)系到溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響，即通過(guò)提高最適溫度來(lái)縮短反應(yīng)時(shí)間。這時(shí)候再提示學(xué)生配置幾只試管，分別設(shè)置不同溫度及時(shí)間［4］，觀察反應(yīng)結(jié)果，從而得出本實(shí)驗(yàn)保溫的最短時(shí)間是多少。如我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將原來(lái)37℃反應(yīng)調(diào)整為40℃～45℃，使保溫時(shí)間從原來(lái)的40～50分鐘縮短為20～30分鐘。

（六）顯色

加顯色粉攪拌時(shí)也一樣，每攪拌一管，玻璃棒要清洗后，再攪拌第二只試管的反應(yīng)液?；蛘咴诒卷?xiàng)操作中可以從第四管開始，依次三、二、一管順序分別攪拌，觀察顏色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般只有第一管顯示為淡紅色，其它各管均為無(wú)色。但試驗(yàn)中也見第二管出現(xiàn)淡紅色的，這要提示學(xué)生正確分析：一方面因?yàn)楦蝿驖{中存在有少量酮體，可以遇顯色粉呈色，但第一管在第二管基礎(chǔ)上有新生成的酮體，故第一管顏色較第二管深；另一方面，第二管在沒(méi)加入底物的條件下是不能生成酮體的，如果肝勻漿中酮體含量少，不會(huì)出現(xiàn)顏色的，可能操作有誤；再者，顏色的深淺和所加的酮體試劑的量有密切的關(guān)系，加的酮體試劑越多，顏色越深，因此要把握酮體粉的量一致。

生化作為醫(yī)學(xué)院校各專業(yè)學(xué)生必修的一門基礎(chǔ)課程，實(shí)驗(yàn)所占比例大，不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是提高教學(xué)質(zhì)量的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)細(xì)節(jié)問(wèn)題的分析與改進(jìn)，一方面，讓學(xué)生規(guī)范操作，減少干擾因素，提高實(shí)驗(yàn)的成功率，培養(yǎng)其創(chuàng)新思維及分析、解決問(wèn)題的能力。另一方面，用科學(xué)、正確的態(tài)度和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)對(duì)待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，正確認(rèn)識(shí)小鼠，學(xué)會(huì)正確拿取，為后續(xù)學(xué)科中小鼠實(shí)驗(yàn)和外科手術(shù)中器械的正確使用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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［4］龍躍娥.酮體生成的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2009，27（11）：159.

中圖分類號(hào)：G642

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2096-000X（2016）10-0136-02

作者簡(jiǎn)介：靳彩虹（1968，6-），女，副教授，研究生學(xué)歷，主要從事生物化學(xué)及生物化學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)和研究工作。