曠勁松，趙玉蓉，趙玉巖，李若溪，辛彩虹

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福辛普利聯合非諾貝特對糖尿病小鼠視網膜病變干預作用的研究

曠勁松1，趙玉蓉1，趙玉巖2，李若溪1，辛彩虹1

摘要:目的探討福辛普利聯合非諾貝特對糖尿病（DM）小鼠視網膜病變（DR）的治療作用及機制。方法ICR小鼠隨機分為5組，每組30只：A組（假造模）、B組（DM模型）、C組[福辛普利干預，20 mg/（kg·d）]、D組[非諾貝特干預，400 mg/（kg·d）]、E組[福辛普利20 mg/（kg·d）+非諾貝特400 mg/（kg·d）干預]。RT-PCR法測定Bax與Bcl-2基因mRNA的表達水平。TUNEL染色法檢測視網膜組織細胞凋亡情況。測定并比較各組谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）、活性氧類物質（ROS）及血管內皮生長因子（VEGF）水平。結果A 組Bcl-2 mRNA、B組Bax mRNA水平高于其他4組；E組Bcl-2 mRNA水平高于C、D組，而Bax mRNA水平低于C、D組（均P＜0.05）。B組TUNEL指數最高，E組＜D組＜C組＜B組（均P＜0.05），但E組與A組差異無統計學意義。B組GSH-PX、SOD活性均低于其他4組，而ROS、MDA、VEGF均高于其他4組；E組GSH-PX、SOD水平均高于C、D組，而ROS、MDA、VEGF均低于C、D組（均P＜0.05）。結論福辛普利和非諾貝特均能通過抑制凋亡與抗氧化對DM小鼠視網膜起到一定的保護作用，兩藥聯合應用效果更佳。

關鍵詞：糖尿病視網膜病變；糖尿病并發(fā)癥；氧化性應激；細胞凋亡；疾病模型，動物；福辛普利；非諾貝特；血管內皮生長因子

作者單位：1沈陽市第四人民醫(yī)院內分泌科（郵編110032）；2沈陽，中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌科

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者最普遍的微血管并發(fā)癥，也是目前眼科4大致盲性眼病之一[1]。臨床DR一旦發(fā)生，即呈進行性進展趨勢，如在DR早期能有效干預，患者預后可明顯改善。福辛普利是一種臨床中常用的血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）。研究證實，腎素血管緊張素醛固酮系統（RAAS）阻斷劑能很好地抑制糖尿病腎病（diabetic nephrosis，DN）的進展[2]；同時RAAS阻斷劑也可抑制糖尿病神經病變（diabetic neuropa?thy，DPN）和DR的進展[3]。此外，非諾貝特作為一種降脂藥，還能降低機體的氧化應激反應[4]。DR發(fā)生、發(fā)展的病理機制之一是視網膜組織細胞的凋亡增多。目前，有研究顯示，早期DR進展過程中氧化應激能導致細胞發(fā)生凋亡[5]。上述2種藥物均已被證實對DR有明確的治療作用，而兩者聯合是否能增強對DR的作用尚少見相關報道。本研究旨在探討福辛普利聯合非諾貝特對糖尿病（DM）小鼠早期DR進展的抑制作用及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1一般材料（1）實驗動物。150只SPF級ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。合格證號SCXK-（京）2007-0001，周齡6～8周，體質量26～30 g（雌鼠），28～32 g（雄鼠）。（2）主要儀器和試劑。PCR儀（德國Biometra公司）；RM2135型石蠟切片機、生物組織包埋機（德國Leica公司）。福新普利鈉片（蒙諾，中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格10 mg/片）；非諾貝特（力平之，法國利博福尼制藥公司，規(guī)格200 mg/片）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；ASD-310S型低溫離心機、鏈脲佐菌素（STZ）、視網膜組織勻漿血管內皮生長因子（VEGF）濃度酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（Sigma公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及活性氧類物質（ROS）檢測試劑盒（南京建成生物科技公司）；Trizol試劑盒（美國Introgen公司）；TUNEL免疫組織化學檢測試劑盒（中杉金橋公司）。One ToucuⅡ型血糖儀（LifeScan公司）。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制作將150只小鼠隨機分為5組，每組30只，雌、雄鼠分開飼養(yǎng)，人工控溫20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水取食。假造模（A）組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余4組（B、C、D及E組）均給予高脂飼料（脂肪含量36%）連續(xù)喂養(yǎng)4周。禁食、水12 h后，A組腹腔注射0.1 mmol/L、pH 4.4的枸櫞酸鈉，其余4組腹腔注射STZ100 mg/kg（用新配制的0.1 mmol/L、pH 4.4的枸櫞酸鈉緩沖液配制），2周后尾緣靜脈抽血測非空腹血糖（BG）＞11.1 mmol/L為成功制作糖尿病小鼠模型[6]。B、C、D及E組分別成功造模24、25、27及27只。模型制作成功后各組依以下方法干預處理8周：A組普通飼料喂養(yǎng)并且灌胃理鹽水；模型（B）組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)并給予生理鹽水灌胃；福辛普利干預（C）組高脂飼料喂養(yǎng)并按20 mg/（kg·d）劑量給予福辛普利溶液灌胃；非諾貝特干預（D）組高脂飼料喂養(yǎng)并按400 mg/ （kg·d）劑量給予非諾貝特溶液灌胃；福辛普利+非諾貝特聯合干預（E）組高脂飼料喂養(yǎng)并給予福辛普利20 mg/（kg·d）+非諾貝特400 mg/（kg·d）溶液灌胃，非諾貝特與福辛普利用0.9%氯化鈉制成混懸液，現用現配。各組干預8周后禁食12 h，靜脈抽血測BG，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4℃預冷的4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.5）200 mL進行心臟灌流，摘除左側眼球，取部分小鼠（14只）制備視網膜組織勻漿待用。其余立即置入4%多聚甲醛固定液，放入4℃冰箱過夜。次日以60%、70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片后續(xù)待用。摘除大鼠右眼眼球，在冰臺上顯微鏡下快速分離視網膜組織，提取DNA，行RT-PCR檢測。

1.2.2 RT-PCR法測定Bax與Bcl-2基因mRNA的表達水平稱取10 mg視網膜組織并按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。鑒定RNA純度與完整性后按試劑盒說明以(oligo) dT為引物逆轉錄合成cDNA第一鏈，以2 μL的cDNA為模板，按試劑盒說明進行PCR擴增，GAPDH為內參照。各引物均由日本TaKaRa公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PCGE）級純化，序列見表1。反應條件：94℃變性1 min，依表1相應退火溫度分別退火50 s，72℃延伸1 min 30 s，33個循環(huán)。擴增產物以20 μL瓊脂糖凝膠電泳40 min，紫外燈（260 nm）下進行檢測。用quantity one軟件分析各目的基因的條帶密度，以GAPDH為內參照計算各個樣本的基因條帶密度的相對值。

Tab. 1 Sequence of oligoneucleotide primers表1 Bax、Bcl-2及GAPDH基因序列及產物長度

1.2.3 TUNEL染色法檢測視網膜組織細胞凋亡情況取每組小鼠10只左側眼球視網膜石蠟包埋切片，按免疫組織化學試劑盒說明書進行操作，封片后在顯微鏡下（×400）進行觀察。對照文獻[7]，細胞核染成棕黃色者為陽性細胞，即凋亡細胞，顯微鏡下觀察并拍照,隨機取7個高倍視野（×400），記數200個細胞中的陽性細胞數,細胞凋亡情況采用末端標記技術TUNEL法檢測，以TUNEL指數表示。

1.2.4 GSH-PX、SOD、ROS酶活性與MDA、VEGF濃度測定取視網膜組織勻漿上清，用ELISA法測定VEGF濃度。視網膜組織勻漿以5 000～10 000 r/min離心5 min，取上清，溫度4℃，按試劑盒說明書測定GSH-PX、SOD與ROS活性，并檢測MDA含量。所取標本均在1周內測定。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x ±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1視網膜細胞Bax、Bcl-2基因mRNA水平檢測結果A～E組中，A組Bax mRNA水平最低，B～E組依次降低，但E組仍高于A組；A組Bcl-2 mRNA水平最高，B～E依次增高，但E組仍低于A組；Bax/ Bcl-2趨勢與Bax相同（均P＜0.05)，見圖1、表2。

Fig. 1 The relative expressions of Bax and Bcl-2 in the level of mRNA圖1 Bax、Bcl-2 mRNA相對表達水平

Tab. 2 The expressions of Bax and Bcl-2 in the level of mRNA表2 Bax、Bcl-2 mRNA相對表達水平（x ±s）

2.2視網膜組織細胞凋亡檢測結果A～E組大鼠TUNEL指數（%）分別為0.98±0.14、4.32±0.67、3.54± 0.43、3.13±0.62及1.23±0.36（F=256.20，P＜0.01）。其中，B組最高，E組＜D組＜C組＜B組（均P＜0.05），但E組與A組差異無統計學意義，見圖2。

2.3各組GSH-PX、SOD、MDA、ROS及VEGF結果比較A～E組中，A組GSH-PX、SOD表達水平最高，B～E依次增高，但E組仍低于A組；A組MDA、ROS表達水平最低，B～E依次降低，但E組仍高于A組；A組VEGF最低，但C組和D組間差異無統計學意義，見表3。

Fig. 2 TUNEL stainingin retinal tissue in each group (TUNEL staining,×400)圖2各組視網膜組織TUNEL染色表達情況（TUNEL染色，×400）

Tab. 3 The activity levels of GSH-PX, SOD, MDA, ROS and VEGFin diabetic retinopathy of diabetic mice表3視網膜組織GSH-PX、SOD、MDA、ROS、VEGFs水平（n=14，x ±s）

3　討論

DR的臨床診斷依據是眼底出現微血管瘤或有出血、滲出等血管形態(tài)學改變，但是在未出現上述血管形態(tài)學異常之前，糖尿病患者已發(fā)生不同程度的視功能異常。研究表明，此時眼底的病理改變主要在視網膜神經細胞、視網膜毛細血管周細胞及內皮細胞，可有明顯的細胞超微結構改變和凋亡，且糖尿病所致的視網膜神經細胞凋亡遠早于微血管病變[8]。Huang等[9]研究表明，高糖狀態(tài)下牛視網膜細胞發(fā)生凋亡，TUNEL指數升高。另有研究顯示，6個月時DM鼠模型眼底改變可等同于人DR的增殖期改變，2～3個月時為早期改變[10]。此外，有研究顯示，3個月的DM大鼠的視網膜神經節(jié)細胞凋亡數目較正常大鼠明顯增加，電鏡示大鼠視網膜感光細胞外節(jié)排列紊亂，m?ller細胞突起消失，神經節(jié)細胞有核染色質固縮等細胞凋亡特征，但微血管內皮細胞、周細胞未見超微結構改變，此可作為大鼠早期視網膜病變模型[11]。

細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA，利用這一原理常常采用TUNEL染色法檢測凋亡細胞。本研究采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ 100 mg/kg，2周后尾緣靜脈抽血測非空腹BG＞11.1 mmol/L，表明成功制作了糖尿病小鼠模型，各組成功率均在80%以上。筆者認為此種方法簡便，成功率較高，值得借鑒。模型制作成功后8周時TUNEL檢測發(fā)現，B、C、D組DM小鼠視網膜組織細胞凋亡數量均較A組正常小鼠明顯增多，表明早期DR模型建立成功。既往有研究證實，非諾貝特、福辛普利均能抑制心肌肥厚細胞發(fā)生凋亡[12]。本研究結果示，E 組Bcl-2 mRNA水平高于C、D組，而Bax mRNA水平低于C、D組，同時TUNEL指數E組＜D組＜C組＜B組，E組與A組無差別，表明非諾貝特、福辛普利均能不同程度抑制DM小鼠視網膜組織細胞的凋亡，且兩藥聯合療效更好。

目前，關于DR視網膜細胞凋亡機制的研究主要集中在氧化應激損傷方面。研究證實，視網膜組織氧化應激可導致神經細胞發(fā)生凋亡[13]。GSH-PX是機體內重要的抗氧化酶，能清除自由基，提高SOD的抗氧化活力，從而阻斷超氧離子誘導的自由基連鎖反應，這兩種酶的活性反映了組織氧化與抗氧化之間的平衡[14]。DR患者的視網膜組織存在過氧化反應，可導致ROS與MDA濃度升高[15]。目前，臨床通常認為氧化應激可導致凋亡相關基因Bax和Bcl-2的不同表達。Bax基因本身發(fā)揮促進凋亡的效應需要與其家族中Bcl-2基因相互協調并形成一個調控體系，當Bax同源二聚體形成時，可誘導細胞凋亡，而Bcl-2蛋白表達量升高時，Bax二聚體可逐漸分開，與Bcl-2蛋白形成更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，A組Bcl-2 mRNA、B組Bax mRNA水平高于其他4組；E組Bcl-2 mRNA水平高于C、D組，表明DM小鼠的Bax基因表達明顯高于正常小鼠，而藥物干預后可抑制Bax表達，增強Bcl-2的表達，發(fā)揮抑制凋亡作用，且聯合使用效果更好。

VEGF是導致DR發(fā)生發(fā)展最重要的分子標志。近期已有研究證實，在DR動物模型的早期即可檢測到血清和視網膜組織中VEGF表達呈明顯的增高[1]。Nebbioso等[17]研究示3個月糖尿病大鼠視網膜m?ller細胞有VEGF表達。福辛普利為一種ACEI，抑制VEGF的作用與其有效抑制了視網膜組織局部RAAS激活和血管緊張素Ⅱ（ATⅡ）的生成有關，而RASS系統的激活和ATⅡ的生成可誘導VEGF產生。目前研究已證實，視網膜組織存在局部RAAS系統，DM時高血糖、氧化應激等因素可誘導視網膜局部RASS激活[18]。本研究結果顯示，B 組GSH-PX、SOD活性均低于其他4組，而ROS、MDA、VEGF水平均高于其他4組，表明DM可造成視網膜組織氧化應激增強和抗氧化平衡的破壞。D 組GSH-PX、SOD活性高于C組，而ROS、MDA均低于C組，C組VEGF低于D組，表明非諾貝特通過其抗氧化作用一方面減少了調亡，另一方面也可抑制視網膜局部RASS，進而降低VEGF的產生，但抑制VEGF作用似乎不如ACEI。E組GSH-PX、SOD活性均高于C、D組，而ROS、MDA、VEGF均低于C、D組，表明兩種藥抑制視網膜細胞凋亡作用機制都是與拮抗氧化應激相關的。因此，單藥比較，福辛普利抑制VEGF效果較非諾貝特好，但兩藥聯合效果更明顯。

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（2015-10-08收稿2015-11-22修回）

（本文編輯陸榮展）

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The studying of fosinopril combined with fenofibrate on the preventing of diabetic retinopathy in diabetic mice

KUANG Jinsong1, ZHAO Yurong1, ZHAO Yuyan2, Li Ruoxi1, Xin Caihong1
1 Department of Endocrinology, The Fourth People′s Hospital of Shenyang, Shenyang 110032, China; 2 Department of Endocrinology,The First Hospital of China Medical University Corresponding Author E-mail：www.sysylrx@126.com

Abstract:Objective To study the effect and mechanism of the Fosinopril combined with Fenofibrate on the prevent?ing of diabetic retinopathy. Methods A total of 150 viripotent ICR mice(100 male mice, 50 female mice) were randomly di?vided into five groups(n=30), including A group (Sham group), B group (Model group), C group [Fosinopril prevented group, 20 mg/(kg·d)], D group [Fenofibrate prevented group, 400 mg/(kg·d)] and E group (Fosinopril combined with Fenofibrate pre?vented group). The expression levels of Bax and Bcl-2 gene mRNA were determined by RT-PCR method. TUNEL staining method was used to detect the apoptosisi of retinal cells. Results The Bcl-2 mRNA of A group, Bax mRNA of B group were higher than those of other four groups. Bcl-2 mRNA of E group was higher than that of C group and D group, while the Bax mRNA was lower than those of two groups（all P＜0.05）. The TUNEL index of B group was the highest than other groups, which of E group＜D group＜C group＜B group（all P＜0.05）, and which of A and E groups were similar. The activi?ties of GSH-PX and SOD of B group were lower than those of other four groups, while the levels of ROS, MDA, VEGF were higher than those of them, the activity of GSH-PX and SOD of E group were higher than those of C and D groups, while the levels of ROS, MDA, VEGF were lower than them（all P＜0.05）. Conclusion Fosinopril and Fenofibrate can improve dia?betic retinopathy through inhibitingthe apoptosis and antioxidation. The combination of them can get even better effect.

Key words:diabetic retinopathy；diabetes complications；oxidative stress；apoptosis；disease models, animal；Fosino?pril；Fenofibrate；vascular endothelial growth factor

中圖分類號：R587.26，R453

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/59086

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81470998）；遼寧省科學計劃項目基金（2011225014）；沈陽市科技計劃項目基金（F11-262-9-25）

作者簡介：曠勁松（1965），女，博士研究生，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事糖尿病并發(fā)癥相關研究

通訊作者E-mail：www.sysylrx@126.com